Comparación y características de los microscopios de fluorescencia y los microscopios ópticos convencionales
Un microscopio de fluorescencia se diferencia de un microscopio óptico común. En lugar de observar muestras bajo la iluminación de una fuente de luz convencional, utiliza luz de una longitud de onda específica (generalmente luz ultravioleta o azul violeta) para excitar sustancias fluorescentes dentro de la muestra, provocando que emitan fluorescencia. Por tanto, la fuente de luz de un microscopio de fluorescencia no sirve para la iluminación directa; actúa como fuente de energía para excitar sustancias fluorescentes endógenas en la muestra. Podemos observar la muestra no debido a la iluminación de la fuente, sino debido a la fluorescencia emitida por las sustancias fluorescentes en la muestra después de absorber la luz de excitación.
De ello se deduce que la característica clave de un microscopio de fluorescencia es su fuente de luz, que puede suministrar abundante luz de excitación dentro de un rango de longitud de onda específico para proporcionar suficiente intensidad de excitación para las sustancias fluorescentes en la muestra de prueba. Mientras tanto, un microscopio de fluorescencia debe estar equipado con el sistema de filtrado correspondiente. Como herramienta esencial para la histoquímica de fluorescencia, consta principalmente de una fuente de luz de presión ultraalta, un conjunto de filtros (que incluye filtros de excitación y filtros de barrera), un sistema óptico y un sistema fotográfico. Funciona excitando muestras con luz de una determinada longitud de onda para producir fluorescencia.
Métodos de excitación por fluorescencia: clasificados por rango de longitud de onda en excitación UV (método de iluminación ultravioleta) y excitación BV (método de luz azul-violeta). La excitación UV utiliza luz casi ultravioleta de menos de 400 nm para la excitación. No interviene luz de excitación visible, por lo que la fluorescencia observada muestra la fluorescencia inherente del tinte. Esto facilita distinguir la fluorescencia específica de la muestra de la autofluorescencia del tejido de fondo.
Método de excitación BV: La excitación se realiza con luz que va desde ultravioleta hasta luz azul, centrada en 404 nm y 434 nm. Dado que la luz azul irradia la muestra en este método, el filtro de corte del sistema de observación de fluorescencia debe bloquear completamente la luz azul mientras transmite completamente la fluorescencia verde y amarilla requerida. Este método se aplica a los fluorocromos utilizados en técnicas de anticuerpos fluorescentes. La longitud de onda máxima de absorción de la luz de excitación y la longitud de onda máxima de emisión de la fluorescencia son relativamente cercanas, por lo que se requieren filtros de corte nítido para la excitación BV. Aquí se utiliza luz azul como luz de excitación, lo que aporta una alta eficiencia de absorción de los fluorocromos y produce imágenes más brillantes. Su inconveniente es que no se puede detectar la fluorescencia por debajo de 500 nm y las señales por encima de 500 nm dan a toda la imagen un tinte amarillo. En los ensayos de anticuerpos fluorescentes, la especificidad se juzga principalmente por el color característico del fluorocromo. Por lo tanto, al evaluar la especificidad sutil, la desventaja anterior del método de excitación BV puede tener un impacto significativo.
