¿Por qué necesito utilizar un microscopio confocal?
1. El microscopio óptico se ha perfeccionado gracias a los esfuerzos y mejoras de nuestros grandes predecesores. De hecho, el microscopio habitual puede proporcionarnos hermosas imágenes microscópicas de forma fácil y rápida. Sin embargo, el acontecimiento que revolucionó el mundo de los microscopios casi perfectos fue la invención del "microscopio confocal de barrido láser". Este nuevo tipo de microscopio se caracteriza por un sistema óptico que extrae información de la imagen únicamente de la superficie en la que se concentra el enfoque, y al cambiar el enfoque mientras se recupera la información adquirida en la memoria de la imagen, es posible obtener una imagen nítida con información dimensional 3-completa. De esta forma, es posible obtener fácilmente información sobre la forma de la superficie que no se puede confirmar con un microscopio convencional. Además, aunque "aumentar la resolución" y "profundizar la profundidad de enfoque" son condiciones contradictorias para los microscopios ópticos convencionales, especialmente con un gran aumento, este problema se resuelve con los microscopios confocales.
2. Ventajas del sistema óptico confocal
Diagrama esquemático del microscopio confocal láser.
El sistema óptico confocal es una iluminación puntual de la muestra, mientras que la luz reflejada también se recibe mediante un receptor puntual. Cuando la muestra se coloca en el punto focal, casi toda la luz reflejada llega al fotorreceptor, y cuando la muestra está desenfocada, la luz reflejada no puede llegar al fotorreceptor. En otras palabras, en un sistema óptico confocal, sólo se emite la imagen que coincide con el punto focal, y se bloquean los puntos y la luz dispersada inútil.
3. ¿Por qué utilizar un láser?
En un sistema óptico confocal, la muestra se ilumina en un punto y la luz reflejada es recibida por un sensor puntual. Por tanto, es necesaria una fuente de luz puntual. Los láseres son en gran medida una fuente de luz puntual. En la mayoría de los casos, la fuente de luz de los microscopios confocales es una fuente de luz láser. Además, la monocromaticidad, la direccionalidad y la excelente forma del haz de los láseres son razones importantes para su adopción generalizada.
4. Es posible la observación en tiempo real basada en escaneo de alta velocidad.
Para el escaneo láser, se utiliza una unidad de desviación óptica acústica (Deflector óptico acústico, AO prime) en dirección horizontal, y un espejo de escaneo de haz controlado servoelectrónicamente (Servo Galvano-espejo) en dirección vertical. Dado que no hay vibración mecánica en el deflector AO, es posible realizar un escaneo a alta velocidad y realizar una observación en tiempo real en la pantalla del monitor. La alta velocidad de esta cámara es un elemento muy importante que afecta directamente a la velocidad de enfoque y recuperación de posición.
5. Relación entre la posición del enfoque y el brillo
En un sistema óptico confocal, la muestra se coloca correctamente en la posición focal cuando el brillo es zui grande, delante y detrás de ella, su brillo se reducirá drásticamente (Figura 4 línea continua). Esta selectividad sensible del plano focal es el principio detrás de la orientación en altura del microscopio confocal y la expansión de la profundidad de enfoque. Por el contrario, los microscopios ópticos habituales no muestran ningún cambio significativo en el brillo antes y después de la posición focal (línea de puntos en la Fig. 4).
6. Alto contraste, alta resolución
En un microscopio óptico convencional, la luz reflejada de la parte desenfocada del microscopio interfiere y se superpone con la parte de imágenes focales del microscopio, lo que resulta en una disminución del contraste de la imagen. Por el contrario, en un sistema óptico confocal, la luz dispersada fuera del punto focal y dentro de la lente del objetivo se elimina casi por completo, lo que da como resultado imágenes con un contraste muy alto. Además, el poder de resolución del microscopio mejora porque la luz pasa dos veces a través de la lente del objetivo, afinando la imagen puntual.
7. Función de localización óptica
En el sistema óptico confocal, la luz reflejada queda protegida por la microapertura en un punto distinto del focal. Como resultado, al observar una muestra tridimensional, la imagen se forma como si la muestra hubiera sido cortada con el punto focal (Fig. 5). Este efecto se denomina localización óptica y es una de las características de los sistemas ópticos confocales.
