Dos métodos comunes de observación microscópica
1. Observación de campo oscuro
La observación de campo oscuro emplea iluminación de campo oscuro. A diferencia de la observación de campo brillante, la luz iluminadora no se ve directamente; sólo se detecta la luz reflejada o difractada por la muestra. Como resultado, el campo de visión tiene un fondo oscuro mientras que la muestra aparece brillante.
La observación del campo oscuro se basa en el efecto Tyndall en óptica. Las partículas de polvo son invisibles para el ojo humano bajo luz intensa directa debido a la difracción de la luz. Cuando la luz incide oblicuamente sobre las partículas, el reflejo de la luz hace que las partículas parezcan agrandadas y visibles.
El accesorio especial necesario para la observación de campo oscuro es un condensador de campo oscuro. Impide que el haz de luz pase verticalmente hacia arriba a través de la muestra. En cambio, redirige la luz para iluminar la muestra en un ángulo oblicuo. La luz iluminadora no ingresa directamente a la lente del objetivo y la luz reflejada y difractada de la superficie de la muestra forma imágenes brillantes. La resolución de la observación de campo oscuro es mucho mayor que la de la observación de campo brillante, alcanzando entre 0,02 y 0,004 μm.
2. Microscopía de contraste de fases
En el desarrollo de los microscopios ópticos, la invención de la microscopía de contraste de fases representa un logro importante en la microscopía moderna. El ojo humano sólo puede distinguir la longitud de onda (color) y la amplitud (brillo) de las ondas luminosas. En el caso de muestras biológicas incoloras y transparentes, la luz pasa a través de ellas con pocos cambios en la longitud de onda o amplitud, lo que las hace difíciles de observar en condiciones de campo brillante.
La microscopía de contraste de fases realiza una inspección basada en la diferencia de trayectoria óptica de la muestra. Utiliza eficazmente la interferencia de la luz para convertir las diferencias de fase (invisibles para el ojo humano) en diferencias de amplitud distinguibles. Incluso las sustancias transparentes e incoloras se pueden visualizar claramente. Esto facilita enormemente la observación de células vivas, por lo que la microscopía de contraste de fases se utiliza ampliamente con microscopios invertidos.
El principio básico del microscopio de contraste de fases es convertir la diferencia de trayectoria óptica de la luz visible transmitida a través de la muestra en una diferencia de amplitud, mejorando así el contraste entre diferentes estructuras y haciéndolas claramente visibles. Después de atravesar la muestra, la luz se refracta, se desvía de su trayectoria original y se retarda 1/4 de longitud de onda. Un retraso o avance adicional de 1/4 de longitud de onda da como resultado una diferencia total en la trayectoria óptica de 1/2 longitud de onda. Los dos haces se superponen e interfieren, aumentando o disminuyendo la amplitud para mejorar el contraste. Estructuralmente, el microscopio de contraste de fases tiene dos características especiales que lo distinguen de los microscopios ópticos comunes.
