La diferencia entre el microscopio de fluorescencia (de dos fotones, confocal) y el microscopio ordinario
El principio básico de la excitación de dos fotones es que a alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber simultáneamente dos fotones de longitud de onda larga y emitir un fotón de longitud de onda más corto después de un corto período de llamado estado de por vida excitado; El efecto es el mismo que usar un fotón con la mitad de la longitud de onda de la longitud de onda larga para excitar moléculas fluorescentes. Dos excitación de fotones requieren una alta densidad de fotones, y para evitar las células dañinas, la microscopía de dos fotones utiliza láseres de pulso bloqueados por modo de alta energía. El láser emitido por este láser tiene alta energía máxima y baja energía promedio, con un ancho de pulso de solo 100 femtosegundos y una frecuencia de hasta 80 a 100 megahercios. Al usar una lente objetivo de apertura numérica alta para enfocar los fotones de un láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente objetivo es la excitación más alta, y la excitación de dos fotones solo ocurre en el punto focal de la lente objetivo. Por lo tanto, el microscopio de dos fotones no requiere un agujero de alfiler confocal, lo que mejora la eficiencia de la detección de fluorescencia.
En fenómenos de fluorescencia general, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón a la vez y luego emitir otro fotón fluorescente a través de la transición radiativa, que se conoce como fluorescencia de fotones individuales. Para los procesos de excitación de fluorescencia utilizando láseres como fuentes de luz, puede ocurrir fenómenos de fluorescencia de dos fotones o incluso multiphoton. En este caso, la fuente de luz de excitación utilizada tiene alta intensidad y densidad de fotones que cumple con el requisito de moléculas fluorescentes para absorber dos fotones simultáneamente. En el proceso de uso de un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones sigue siendo insuficiente para producir un fenómeno de absorción de dos fotones. Por lo general, se utilizan láseres de pulso de femtosegundos, con una potencia instantánea que alcanza el nivel de megavatio. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la de la luz de excitación, equivalente al efecto producido por la excitación de la longitud de onda de la mitad de excitación.
Conocimiento relacionado con la microscopía de fluorescencia confocal
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal es usar una fuente de luz puntual para irradiar la muestra, formando un pequeño punto de luz bien definido en el plano focal. La fluorescencia emitida desde este lugar después de la irradiación es recolectada por la lente objetivo y enviada de nuevo a lo largo de la ruta de irradiación original hacia el divisor del haz compuesto por un espejo dicroico. El espectrómetro envía fluorescencia directamente al detector. Hay un agujero de alfiler frente a la fuente de luz y el detector, llamado agujero de iluminación y el agujero de detección, respectivamente. Las dimensiones geométricas de los dos son consistentes, aproximadamente 100-200 nm; En comparación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, lo que significa que el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y, en última instancia, puede centrarse tanto en el agujero de iluminación como en el agujero de detección simultáneamente. De esta manera, la luz del plano focal puede converger dentro del rango del orificio de detección, mientras que la luz dispersa desde arriba o debajo del plano focal se bloquea fuera del orificio de detección y no se puede obtener imágenes. Escaneo del punto de muestra por punto con un láser, el tubo fotomultiplicador después de detectar el agujero de alfiler también obtiene la imagen confocal correspondiente del punto de luz de luz por punto, lo convierte en una señal digital y la transmite a la computadora, y finalmente la agrega en una imagen confocal clara de todo el plano focal en la pantalla.
