Procedimiento estándar para calibrar polarizadores en un microscopio polarizador
El microscopio de fluorescencia se diferencia del microscopio óptico común en que no observa muestras bajo la iluminación de fuentes de luz comunes. En cambio, utiliza una determinada longitud de onda de luz (generalmente luz ultravioleta, luz azul violeta) para excitar las sustancias fluorescentes dentro de la muestra bajo el microscopio, haciendo que emitan fluorescencia. Por lo tanto, el papel de la fuente de luz en el microscopio de fluorescencia no es la iluminación directa, sino la de fuente de energía para excitar las sustancias fluorescentes dentro de la muestra. La razón por la que podemos observar muestras no se debe a la iluminación de la fuente de luz, sino al fenómeno de fluorescencia exhibido por las sustancias fluorescentes dentro de la muestra después de absorber la energía luminosa excitada. A partir de esto, se puede ver que la característica de la microscopía de fluorescencia es principalmente que su fuente de luz puede suministrar una gran cantidad de luz de excitación en un rango de longitud de onda específico, de modo que las sustancias fluorescentes en la muestra puedan obtener la intensidad necesaria de luz de excitación. Al mismo tiempo, los microscopios de fluorescencia deben disponer de los correspondientes sistemas de filtrado. El microscopio de fluorescencia es una herramienta fundamental en la química de tejidos por fluorescencia. Se compone de componentes principales como una fuente de luz de voltaje ultra-alto, un sistema de filtro (que incluye placas de filtro de excitación y supresión), un sistema óptico y un sistema de fotografía. Utiliza luz de una determinada longitud de onda para excitar la muestra y emitir fluorescencia.
1. Métodos de excitación por fluorescencia: Según el rango de longitud de onda de la luz, existen dos tipos: método de excitación UV (utilizando iluminación ultravioleta) y método de excitación BV (utilizando luz azul violeta). El método de excitación UV utiliza luz casi ultravioleta de menos de 400 nm para la excitación. Este método no tiene luz de excitación visible, por lo que la fluorescencia observada exhibe la fluorescencia inherente del tinte, lo que facilita distinguir la fluorescencia específica de la muestra de la autofluorescencia del tejido de fondo.
2. Método de excitación BV: Implica la excitación de luz ultravioleta a luz azul centrada en 404 nm y 434 nm. Este método utiliza luz azul para irradiar la muestra, por lo que el filtro de corte-del sistema de observación de fluorescencia debe usar un filtro que pueda bloquear completamente la luz azul y pasar completamente a través de la fluorescencia verde y amarilla requerida. Pigmentos fluorescentes utilizados para el método de anticuerpos fluorescentes. La longitud de onda de absorción máxima de la luz de excitación y la longitud de onda de emisión máxima de la fluorescencia son relativamente cercanas, por lo que el filtro utilizado en el método de excitación BV debe utilizar un filtro de corte agudo. Este método puede utilizar luz azul como luz de excitación, por lo que la eficiencia de absorción de los pigmentos fluorescentes es alta y se pueden obtener imágenes más brillantes. La desventaja es que no se puede ver la fluorescencia por debajo de 500 nm, mientras que la fluorescencia por encima de 500 nm hace que toda la imagen parezca amarilla. En el método de anticuerpos fluorescentes, la especificidad está determinada principalmente por el color exclusivo de los pigmentos fluorescentes, por lo que cuando se habla de especificidad sutil, los inconvenientes del método de excitación BV mencionado anteriormente suelen tener un impacto significativo.
