Principios de microscopía de fluorescencia
Los microscopios de fluorescencia son diferentes de los microscopios ópticos ordinarios. En lugar de observar especímenes bajo la iluminación de fuentes de luz ordinarias, usan luz de cierta longitud de onda (generalmente luz ultravioleta, luz azul-violeta) para excitar las sustancias fluorescentes en los especímenes bajo el microscopio para que emitan fluorescencia. Por lo tanto, la fuente de luz de un microscopio de fluorescencia no funciona como iluminación directa, sino como una fuente de energía que excita las sustancias fluorescentes dentro de la muestra. La razón por la que podemos observar la muestra se debe a la iluminación de la fuente de luz, pero el fenómeno de fluorescencia que se presenta después de que la sustancia fluorescente en la muestra absorba la energía de la luz excitada.
Se puede ver que la característica del microscopio de fluorescencia es que su fuente de luz puede suministrar una gran cantidad de luz de excitación en un rango de longitud de onda específico, de modo que la sustancia fluorescente en la muestra analizada pueda obtener la luz de excitación de la intensidad necesaria. Al mismo tiempo, el microscopio de fluorescencia debe tener el sistema de filtrado correspondiente.
La microscopía de fluorescencia es una herramienta esencial en la histoquímica de inmunofluorescencia. Está compuesto por una fuente de luz de voltaje ultra alto, un sistema de filtro (que incluye una placa de filtro de excitación y supresión), un sistema óptico y un sistema de fotografía y otros componentes principales. Utiliza luz de cierta longitud de onda para excitar la muestra y emitir fluorescencia.
La forma de excitar la fluorescencia: según el rango de longitud de onda de la luz, se puede dividir en dos tipos: método de excitación UV (usando el método de iluminación ultravioleta) y método de excitación BV (usando luz azul-violeta). El método de excitación UV utiliza luz casi ultravioleta de menos de 400 nm para la excitación. No hay luz de excitación visible en este método, por lo que la fluorescencia observada presenta la fluorescencia inherente del tinte y es fácil distinguir la fluorescencia específica en la muestra de la autofluorescencia del tejido de fondo.
El método de excitación BV se basa en 404nm y 434nm para la excitación de la luz ultravioleta a la azul. Este método usa luz azul para irradiar la muestra, por lo que el filtro de corte del sistema de observación de fluorescencia debe usar un filtro que pueda bloquear completamente la luz azul y pasar completamente la fluorescencia verde y amarilla requerida. Tintes fluorescentes para ensayos de anticuerpos fluorescentes. La longitud de onda de absorción máxima de la luz de excitación está relativamente cerca de la longitud de onda de emisión máxima de la fluorescencia, por lo que el filtro utilizado en el método de excitación BV debe utilizar un filtro de corte nítido. Este método puede usar luz azul como luz de excitación, por lo que la eficiencia de absorción del pigmento fluorescente es mayor y se puede obtener una imagen más brillante. Su desventaja es que la fluorescencia por debajo de 500nm no se puede ver, y la fluorescencia por encima de 500nm hace que toda la imagen parezca amarilla. En el método de anticuerpos fluorescentes, la especificidad del fluorocromo a menudo se juzga por el color exclusivo del fluorocromo. Por lo tanto, cuando se habla de especificidad sutil, las deficiencias mencionadas anteriormente del método de excitación BV a menudo tienen una gran influencia.
En resumen, la iluminación del microscopio de fluorescencia se puede considerar de acuerdo con los siguientes tres puntos según la estructura del condensador y la longitud de onda de la luz de excitación.
① Desde la perspectiva de los requisitos de contraste de la imagen fluorescente, el concentrador de campo oscuro de excitación UV se utiliza para la iluminación.
② Teniendo en cuenta el brillo de la imagen, el filtro de excitación BV tiene la mayor eficiencia de observación de campo oscuro.
③Las características de la observación de campo oscuro del filtro de excitación UV y la iluminación del concentrador de campo oscuro de excitación BV se pueden considerar entre estos dos métodos de iluminación, pero el primero tiene propiedades de campo oscuro más fuertes y muestra imágenes más brillantes. El contraste es pequeño; este último conserva las propiedades de la ruta de luz de campo oscuro, por lo que la imagen mostrada es más oscura y se mejora el contraste. Cuando se utiliza realmente un microscopio de fluorescencia, se debe utilizar para la observación el método de iluminación que mejor se adapte a los requisitos de la muestra.
Debe señalarse que incluso si se ilumina el condensador de campo oscuro excitado por UV con el mejor contraste, parte de la luz de excitación ultravioleta refractada o dispersada por la muestra entrará en la lente del objetivo. La autofluorescencia puede empeorar la respuesta de la imagen. Por lo tanto, se debe usar un filtro absorbente de UV delante del ocular como filtro de corte.
