Principio y aplicación de la microscopía de fluorescencia
(1) El principio y las características estructurales del microscopio de fluorescencia: el microscopio de fluorescencia utiliza una fuente de luz puntual con alta eficiencia luminosa para emitir luz de una cierta longitud de onda (como luz ultravioleta de 3650 pulgadas o luz azul púrpura de 4200 pulgadas) a través del sistema de filtro como la luz de excitación para excitar la muestra. Después de que la sustancia fluorescente del interior emita fluorescencia de varios colores, se observa a través del aumento de la lente del objetivo y el ocular. De esta forma, bajo un fondo de fuerte contraste, incluso si la fluorescencia es muy débil, es fácil de identificar y tiene una alta sensibilidad. Se utiliza principalmente para la investigación de la estructura y función celular y la composición química. La estructura básica de un microscopio de fluorescencia se compone de un microscopio óptico ordinario más algunos accesorios (como una fuente de luz fluorescente, un filtro de excitación, un divisor de haz de dos colores y un filtro de bloqueo, etc.). Fuente de luz fluorescente: generalmente utiliza una lámpara de mercurio de ultra alta presión (50-200W), que puede emitir luz de varias longitudes de onda, pero cada sustancia fluorescente tiene una longitud de onda de excitación que produce la fluorescencia más fuerte, por lo que es necesario agregar una filtro de excitación (generalmente, hay filtros de excitación ultravioleta, púrpura, azul y verde), que solo permiten el paso de la luz de excitación de una cierta longitud de onda e irradian la muestra, mientras absorben otra luz. Después de que cada sustancia es irradiada por la luz de excitación, emite fluorescencia visible con una longitud de onda más larga que la longitud de onda de la irradiación en muy poco tiempo. La fluorescencia es específica y generalmente más débil que la luz de excitación. Para observar una fluorescencia específica, se requiere un filtro de bloqueo (o supresión) detrás de la lente del objetivo. Tiene dos funciones: una es absorber y bloquear la entrada de la luz de excitación en el ocular, para no perturbar la fluorescencia y dañar los ojos; la otra es seleccionar y dejar pasar la fluorescencia específica, mostrando un color fluorescente específico. Los dos filtros deben usarse juntos.
Hay dos tipos de microscopios de fluorescencia en términos de sus caminos ópticos:
1. Microscopio de fluorescencia de transmisión: la fuente de luz de excitación excita la fluorescencia a través del material de la muestra a través de la lente del condensador. Comúnmente se usa un colector de campo oscuro, y también se puede usar un colector ordinario para ajustar el espejo de modo que la luz de excitación se transmita y se desvíe a la muestra. Este es un microscopio de fluorescencia anticuado. La ventaja es que la fluorescencia es fuerte a bajo aumento y la desventaja es que la fluorescencia disminuye con el aumento del aumento. Por lo tanto, es mejor para observar muestras de materiales más grandes.
2. Microscopio de epifluorescencia Este es un nuevo tipo de microscopio de fluorescencia desarrollado en los tiempos modernos. La diferencia es que la luz de excitación cae desde la lente del objetivo a la superficie de la muestra, es decir, se usa la misma lente del objetivo como condensador de iluminación y lente del objetivo para recolectar la fluorescencia. Es necesario agregar un divisor de haz dicroico en la trayectoria de la luz, que está a 45 grados del uranio ligero. La luz de excitación se refleja en la lente del objetivo y se recoge en la muestra. La fluorescencia generada por la muestra y la luz de excitación reflejada por la superficie de la lente del objetivo y la superficie del cubreobjetos entran en la lente del objetivo al mismo tiempo y regresan al divisor de haz de dos colores para hacer que la luz de excitación se separe de la fluorescencia. , la luz de excitación residual es absorbida por filtros de bloqueo. Si cambia a una combinación de diferentes filtros de excitación/divisores de haz de dos colores/filtros de bloqueo, se pueden satisfacer las necesidades de diferentes productos de reacción fluorescente. La ventaja de este tipo de microscopio de fluorescencia es que la iluminación del campo de visión es uniforme, la imagen es clara y cuanto mayor es el aumento, más fuerte es la fluorescencia.
(2) Cómo utilizar el microscopio de fluorescencia.
1. Encienda la fuente de luz, la lámpara de mercurio de ultra alta presión necesita calentarse durante unos minutos para alcanzar el punto más brillante.
2. Para el microscopio de fluorescencia de transmisión, el filtro de excitación requerido debe instalarse entre la fuente de luz y el condensador, y el filtro de bloqueo correspondiente debe instalarse detrás de la lente del objetivo. Los microscopios de epifluorescencia deben insertar el filtro de excitación/divisor de haz de dos colores/filtros de bloqueo requeridos en las ranuras de la trayectoria de la luz.
3. Observe con una lente de bajo aumento y ajuste el centro de la fuente de luz de acuerdo con el dispositivo de ajuste de diferentes tipos de microscopios de fluorescencia para que esté ubicado en el centro de todo el punto de iluminación.
4. Coloque la hoja de muestra y observe después de enfocar. Se debe prestar atención durante el uso: no observe directamente con el filtro final, para no causar daño a los ojos; al observar la muestra con una lente de aceite, se debe usar una lente de aceite especial sin fluorescencia; después de apagar la lámpara de mercurio de alta presión, no se puede volver a encender inmediatamente y debe probarse. Se puede reiniciar después de 5 minutos, de lo contrario será inestable y afectará la vida útil de la lámpara de mercurio.
(3) Observación Usando un filtro de luz azul-violeta bajo un microscopio fluorescente en la plataforma de enseñanza, se puede ver que las células teñidas con un tinte fluorescente naranja de acridina al 0,01 por ciento, el núcleo y el citoplasma se excitan para producir dos colores diferentes de fluorescencia (oscura) verde y rojo anaranjado).
