Métodos para ampliar la profundidad focal de microscopios multifotónicos
La combinación de un microscopio de barrido láser de dos-fotones y un indicador de calcio es el estándar de oro para la detección de señales neuronales in vivo. Las neuronas de las redes neuronales están distribuidas en un espacio tridimensional-y monitorear la dinámica de su actividad requiere una forma de mejorar rápidamente la tasa de imágenes de volumen. Sin embargo, al utilizar un microscopio multifotónico de barrido de rejilla para obtener imágenes de una gran cantidad de imágenes, si se utiliza un objetivo de alta apertura numérica (NA) para lograr una resolución lateral más alta, se obtendrá una profundidad focal más pequeña. Para obtener imágenes de volumen a una profundidad focal pequeña,
Es necesario realizar un escaneo del eje Z-a través de algún medio, generando imágenes de muchos planos escaneando cada plano focal, lo que limita en gran medida la velocidad de la imagen. Si se puede sacrificar la información de la imagen axial y se puede lograr un escaneo de volumen en un escaneo lateral extendiendo la profundidad de enfoque, es decir, la información de volumen se proyecta en una única imagen 2D, la velocidad de obtención de imágenes se puede mejorar considerablemente. Esto se llama imágenes de profundidad de enfoque extendida (EDF), que es particularmente útil para obtener imágenes de estructuras de poblaciones dispersas que requieren una alta resolución temporal, como imágenes funcionales de la actividad neuronal.
Las resoluciones axial y lateral de un microscopio están determinadas por la apertura numérica (NA) de la lente del objetivo. Una NA alta puede maximizar la resolución axial y lateral, así como la cantidad de luz captada; Una NA más baja dará como resultado una resolución axial más baja, es decir, una mayor profundidad de enfoque, pero al mismo tiempo sacrificará la resolución lateral y la eficiencia de recolección de luz. El método de ampliar la profundidad de enfoque que se presentará a continuación puede lograrlo manteniendo una alta resolución lateral y un flujo de luz suficiente.
El uso de moduladores de luz espaciales para generar haces de Bessel delgados y focales puede lograr imágenes EDF, pero los moduladores de luz espaciales son voluminosos y difíciles de ser compatibles con espacios estrechos de microscopio; Por el contrario, los módulos Bessel basados en pirámides axiales son baratos y compactos, pero sólo pueden generar puntos focales de profundidad fija y no son adecuados para diversos experimentos que requieren cambios continuos en la profundidad focal. Para abordar esta cuestión, en 2018, RONGWEN LU et al. demostró un módulo Bessel basado en un axicon, en el que solo es necesario trasladar una lente a lo largo del eje óptico para ajustar continuamente la longitud axial del punto focal Bessel.
Figura 1 (a) Diagrama del dispositivo del módulo Bessel; (b) La función de dispersión del punto se midió experimentalmente cuando D era -12 mm, 0 mm y 12 mm, respectivamente; (c) La relación entre el ancho lateral total a la mitad del máximo, (d) el ancho axial total a la mitad del máximo, (e) la señal máxima y (f) la potencia óptica detrás de la lente del objetivo con desplazamiento L2 D
El dispositivo modular para formar un punto focal Bessel de longitud variable se muestra en la Figura 1a. Al haz gaussiano incidente se le da forma de haz circular después de pasar a través de un axicon y una lente L1. La máscara de apertura circular posterior puede bloquear la luz parásita causada por defectos del axicon, dando forma así a la distribución axial de la función de dispersión del punto de excitación de dos-fotones. Posteriormente, el haz de luz se proyecta sobre el galvanómetro mediante las lentes L2 y L3, y luego llega al plano focal posterior de la lente objetivo a través de las lentes L4 y L5.
Estos diseños son similares a los módulos tradicionales basados en pirámide, con la diferencia de que moviendo L2 o L3 a lo largo del eje óptico, la longitud axial del enfoque Bessel se puede ajustar continuamente. La Figura 1b muestra las funciones de dispersión del punto axial para valores D de -12 mm, 0 mm y 12 mm, con un ancho axial completo a la mitad del máximo de 39? m,24? ¿M y 14? metro. Como se muestra en la Figura 1c-f, mover la lente L2 de izquierda a derecha puede cambiar continuamente el ancho total a la mitad del máximo tanto en la dirección transversal como en la axial, lo que significa que la profundidad de enfoque se puede cambiar continuamente. Los resultados de la simulación numérica basados en la teoría de la difracción vectorial concuerdan bien con los datos experimentales. La Figura 2 verifica el efecto de corrección de diferentes tamaños de máscaras anulares en los defectos del axicon. Se ha descubierto que las máscaras anulares más delgadas pueden optimizar mejor la distribución de intensidad axial del haz de Bessel de salida, pero al mismo tiempo, también provocan una mayor pérdida de potencia.
