Diseño de microscopio de campo brillante y fluorescencia de bajo costo
La microscopía de fluorescencia es un método utilizado para visualizar la
En esta guía, revisaré los conceptos básicos de la microscopía de fluorescencia y cómo construir tres microscopios de fluorescencia diferentes de bajo costo. Estos sistemas suelen costar miles de dólares, pero recientemente se han realizado algunos esfuerzos para hacerlos más accesibles. Los diseños que presento aquí utilizan un teléfono inteligente, una dSLR y un microscopio USB. Todos estos diseños también pueden utilizarse como microscopios de campo claro.
Paso 1: descripción general de la microscopía de fluorescencia
Para comprender los conceptos básicos de la microscopía de fluorescencia, imagine un bosque denso por la noche, con árboles, animales, arbustos y otros bosques vivos. Si iluminas el bosque con una antorcha, verás todas estas estructuras y te resultará difícil visualizar animales o plantas específicas. Supongamos que sólo le interesa ver los arbustos de arándanos en el bosque. Para ello, entrenas a la luciérnaga para que se sienta atraída únicamente por los arbustos de arándanos, de modo que cuando mires el bosque, sólo se iluminen los arbustos de arándanos. Se podría decir que utilizas luciérnagas para marcar los arbustos de arándanos y poder ver las estructuras de los arándanos en el bosque.
En esta analogía, el bosque representa la muestra completa, los arbustos de arándanos representan las estructuras que desea visualizar (por ejemplo, células específicas u orgánulos subcelulares) y las luciérnagas son compuestos fluorescentes. Iluminar la antorcha sola sin las luciérnagas es similar a la microscopía de campo brillante.
El siguiente paso es comprender la función básica de los compuestos fluorescentes (también conocidos como fluoróforos). Los fluoróforos son en realidad objetos pequeños (a nanoescala) diseñados para conectar estructuras específicas en una muestra. Absorben una gama estrecha de longitudes de onda de luz y reemiten otra longitud de onda de luz. Por ejemplo, un fluoróforo puede absorber luz azul (es decir, el fluoróforo es excitado por la luz azul) y luego reemitir luz verde. Esto generalmente se resume en los espectros de excitación y emisión (arriba). Estos diagramas muestran la longitud de onda de la luz absorbida por el fluoróforo y la longitud de onda de la luz emitida por el fluoróforo.
El diseño del microscopio es muy similar al de un microscopio de campo claro normal, con dos diferencias principales. En primer lugar, la luz que ilumina la muestra debe tener la longitud de onda que excita el fluoróforo (en el ejemplo anterior, la luz es azul). En segundo lugar, el microscopio sólo necesita recoger la luz emitida (luz verde) mientras bloquea la luz azul. Esto se debe a que la luz azul está en todas partes, pero la luz verde solo proviene de estructuras específicas de la muestra. Para bloquear la luz azul, los microscopios suelen tener algo llamado filtro de paso largo que deja pasar la luz verde sin luz azul. Cada filtro de paso largo tiene una longitud de onda de corte. Si la luz tiene una longitud de onda mayor que la longitud de onda de corte, puede atravesar el filtro. De ahí el nombre de "pase largo". Se bloquean las longitudes de onda más cortas.
Paso 2: Modelar el microscopio con óptica óptica.
Este es un paso adicional a los principios básicos del diseño de microscopios. No es necesario construir un microscopio de fluorescencia, por lo que puedes omitirlo si no quieres profundizar en la óptica.
Tanto los microscopios de campo claro como los de fluorescencia se pueden modelar utilizando óptica de rayos. La premisa básica de la óptica de rayos es que la luz se comporta de manera similar a la luz que se aleja de una fuente de luz. Cuando miras alrededor de una habitación, ves la luz del sol que sale de una ventana o de una bombilla. Luego, la luz es absorbida o reflejada por los objetos de la habitación. Parte de la luz reflejada hace que se dirija hacia los ojos. Si el objeto está iluminado, puedes imaginar cada punto del objeto emitiendo luz en todas direcciones (arriba). La lente, como la lente de nuestros ojos, enfoca la luz en un punto para que podamos ver el objeto. Sin lente, la luz continúa viajando hacia afuera y no forma una imagen.
Entonces, ¿cómo fabricamos sistemas ópticos que magnifiquen objetos pequeños? Para comprender el diseño, en realidad sólo necesita conocer dos ecuaciones: las ecuaciones de imagen de lente delgada y de aumento:
1/F=1/SI + 1/SO
M=-si/así
f es la distancia focal de la lente. Una distancia focal más corta significa que la lente tiene más poder de enfoque.
Lo mismo ocurre con la distancia al objeto; la distancia entre la lente y el objeto (por ejemplo, un árbol).
si es la distancia de la imagen; la distancia entre la lente y donde se forma la imagen
M es aumento; qué tan grande es la imagen en relación con el objeto. Para los microscopios, queremos aumentar el aumento.
Para ver un tutorial completo sobre la ecuación de las lentes delgadas, mira este video de Khan Academia. En el gif de arriba, puede ver que la distancia entre el objeto y la lente aumenta la distancia de la imagen, lo que aumenta la ampliación. La línea vertical con dos flechas indica la lente.
