Microscopía confocal láser: características y aplicaciones
La microscopía confocal de barrido láser (LSCM) es un tipo de microscopio diseñado basándose en la tecnología de enfoque conjugado, es decir, la fuente de luz láser, la muestra a medir y el detector están todos en posiciones conjugadas entre sí.
Fundamental
En un microscopio general, el plano de observación de la imagen se aísla del plano axial adyacente haciendo coincidir el plano focal de la lente objetivo con el detector, mientras que en un microscopio confocal, se utiliza un punto de luz de difracción limitada para iluminar la muestra y A Se utiliza un orificio estenopeico en la trayectoria de la luz recolectada en el foco conjugado del punto de luz para filtrar la luz parásita y crear este efecto de aislamiento y así mejorar la resolución.
Funciones de imagen
Imágenes de escaneo de sección óptica
Otra característica de la microscopía confocal de barrido láser es que es una tecnología de imágenes de barrido. La tecnología tradicional de iluminación de campo amplio ilumina toda la muestra, por lo que la imagen puede capturarse directamente a simple vista o con un detector, pero LSCM utiliza un haz o múltiples haces enfocados que pasan a través de la muestra para escanear y obtener imágenes. La imagen resultante se llama sección óptica. A continuación se muestra la diferencia entre el método tradicional de iluminación de campo amplio y el método de iluminación confocal de escaneo láser.
Por lo tanto, un método de trabajo real de un microscopio confocal moderno es el que se muestra en la siguiente figura. La luz de excitación emitida por el láser pasa a través de un espejo dicroico y se escanea en las direcciones x e y de la muestra a través de un par de galvanómetros. La excitación (o reflexión) de la muestra es La luz ingresa al detector PMT a través del orificio y se registra, y la imagen escaneada grabada es reconstruida por una computadora para reconstruir la imagen de la muestra real.
Genere imágenes "z-stack" en diferentes planos focales
Sólo la luz reflejada desde la capa de muestra conjugada puede pasar a través del pequeño orificio en el camino de luz de recolección, y los reflejos irrelevantes restantes de la capa de muestra son bloqueados por el pequeño orificio. Esto puede dar como resultado mejoras significativas en la resolución. Comparación lado a lado de microscopía de fluorescencia multidimensional y microscopía confocal de la misma muestra gruesa. Cuando se toman una serie de imágenes en diferentes planos focales, se pueden generar imágenes comúnmente denominadas "pilas z", que ilustran las ganancias de resolución y contraste que ofrece la microscopía confocal y las causas subyacentes de estas ganancias. Se puede ver que al examinar la imagen en la parte superior de la pila con el plano de imagen sobre el tejido se revela una gran cantidad de luz dispersa en la imagen de fluorescencia, mientras que la imagen de microscopía confocal aparece negra. Esta reducción en el PSF axial da como resultado directamente la diferencia de resolución observada en la interfaz óptica en el medio del z-stack.
La resolución ha mejorado mucho en comparación con la iluminación de campo amplio.
En microscopía de fluorescencia, la intensidad de la luz emitida desde un solo punto se describe mediante la función de dispersión puntual (PSF) y su patrón es un disco de Airy. La resolución del sistema de fluorescencia se puede describir mediante el radio del disco de Airy, que se puede describir mediante la apertura numérica de la lente objetivo y la longitud de onda de la luz de excitación.
