¿Cómo se observa la morfología de las células microbianas al microscopio?
Los microscopios se inventaron para ver objetos sonrientes que no se pueden ver a simple vista. Los microorganismos son muy pequeños, por lo que hay que magnificarlos y observarlos con ayuda de un microscopio. Además, existen muchos tipos de microorganismos, por lo que básicamente la mayoría de los microscopios ópticos pueden observar microorganismos. La siguiente pregunta es qué tipo de microscopio se debe utilizar para la observación y análisis de qué tipo de microorganismos. Los microscopios comunes que se pueden utilizar para observar la morfología microbiana incluyen microscopios biológicos, microscopios de contraste de fases, microscopios invertidos, microscopios de fluorescencia, microscopios confocales, etc.
A continuación se describen los distintos microscopios utilizados para observar microorganismos:
1. El microscopio óptico común utiliza luz natural o luz como fuente de luz y su longitud de onda es de aproximadamente 0.4 μm. La resolución del microscopio es la mitad de la longitud de onda, es decir, 0.2 μm, y la imagen más pequeña visible a simple vista es 0.2 mm. Por lo tanto, usar un espejo de aceite (inmersión) para ampliar 1000 veces puede ampliar las partículas de 0,2 μm a 0,2 mm visibles a simple vista. Para la observación de bacterias, actinomicetos y hongos se pueden utilizar microscopios ópticos convencionales.
2. La microscopía de campo oscuro se utiliza comúnmente para observar la morfología y el movimiento microbiano sin teñir. Una vez instalado el condensador de campo oscuro en el microscopio normal, la luz no puede penetrar directamente desde el centro y el campo de visión es oscuro. Cuando la muestra recibe luz oblicua desde el borde del condensador, puede dispersarse, por lo que se pueden observar microorganismos brillantes como bacterias o espiroquetas en el fondo oscuro del campo.
3. Microscopio de contraste de fase El microscopio de contraste de fase utiliza el efecto de luz de la placa de diferencia de fase para cambiar la fase de luz y la amplitud de la luz directa, y convertir la diferencia de fase de luz en diferencia de intensidad de luz. Bajo un microscopio de contraste de fases, cuando la luz pasa a través de una muestra sin teñir, la diferencia en la fase de la luz es causada por la inconsistencia de la densidad de las diferentes partes de la muestra, y se puede observar la morfología, la estructura interna y el modo de movimiento de los microorganismos.
4. Microscopio de fluorescencia El microscopio de fluorescencia es básicamente el mismo que el microscopio óptico común, la principal diferencia es la fuente de luz, el filtro y el condensador. En la actualidad, la mayoría de ellos utilizan dispositivos epi-light y las lámparas de mercurio de alta presión se utilizan comúnmente como fuentes de luz, que pueden emitir luz ultravioleta o azul violeta. Hay dos tipos de filtros: filtro de excitación y filtro de absorción. Además de los condensadores generales de campo brillante, también se pueden utilizar condensadores de campo oscuro en microscopios de fluorescencia que utilizan luz azul para mejorar el contraste entre la fluorescencia y el fondo. Este método es aplicable a la detección o identificación de bacterias teñidas con pigmentos fluorescentes o combinadas con anticuerpos fluorescentes.
5. Los microscopios electrónicos utilizan el flujo de electrones como fuente de luz y la longitud de onda es decenas de miles de veces diferente de la luz visible, lo que mejora enormemente la resolución. También utiliza una bobina magnética como sistema de amplificación óptica, y la ampliación puede alcanzar decenas de miles o cientos de miles de veces. A menudo se utiliza para observar partículas de virus y ultraestructura bacteriana.
Observación de muestras microbianas no teñidas:
Las muestras sin teñir generalmente se pueden utilizar para observar la morfología, la potencia y el movimiento de las bacterias. Las bacterias son incoloras y transparentes cuando no están teñidas y se observan al microscopio principalmente por la diferencia entre el índice de refracción de las bacterias y el entorno que las rodea. Las bacterias con flagelos se mueven vigorosamente, mientras que las bacterias sin flagelos muestran un movimiento browniano irregular. Las bacterias viables como Treponema pallidum, Leptospira y Campylobacter tienen formas y patrones de movimiento distintivos, que son de importancia diagnóstica. Los métodos más utilizados son el método de caída de presión, el método de caída colgante y el método capilar.
1. Aplique vaselina alrededor del orificio cóncavo del vidrio cóncavo limpio mediante el método de la gota colgante, use un asa de inoculación para tomar un anillo de suspensión bacteriana y colóquelo en el centro del cubreobjetos, luego alinee el orificio cóncavo del vidrio cóncavo con coloque la gota en el centro del cubreobjetos y cúbralo, luego déle la vuelta rápidamente, presione ligeramente el cubreobjetos para que se adhiera firmemente a la vaselina en el borde del orificio cóncavo y observe con un microscopio de gran aumento (o campo oscuro).
2. Tome un anillo de suspensión bacteriana con un asa de inoculación y colóquelo en el centro de un portaobjetos de vidrio limpio mediante el método de caída de presión, y cubra suavemente la suspensión bacteriana con un cubreobjetos, teniendo cuidado de evitar burbujas y desbordamiento de la suspensión bacteriana. . Después de permanecer quieto durante unos segundos, observe bajo un microscopio de alta potencia en campo brillante (o campo oscuro).
3. El método capilar se utiliza principalmente para examinar la cinética de bacterias anaeróbicas. Por lo general, elija entre 60~70 mm de largo. Después de sifonar la suspensión de bacterias anaeróbicas a través de un capilar con una apertura de 0,5-1.0 mm, selle los dos extremos del capilar con una llama. El capilar se fijó sobre el portaobjetos de vidrio con papel plástico y se observó bajo una lente de alta potencia en campo oscuro.
Observación de muestras microbianas teñidas con un microscopio:
Después de teñir la muestra bacteriana, debido al marcado contraste de color entre las bacterias y el entorno circundante, las características morfológicas de las bacterias (como el tamaño, la forma, la disposición, etc.) de las bacterias y algunas estructuras especiales (como como cápsulas, flagelos, esporas, etc.) se pueden observar claramente bajo un microscopio óptico común, y las bacterias se pueden clasificar e identificar según la reactividad de la tinción.
(1) Procedimiento general de tinción bacteriana El procedimiento general de tinción bacteriana es: frotis (secado)—fijación—tinción.
1. Frotis Preparación de sangre, secreciones, excreciones, líquido de punción y cultivo líquido, y extendido directo en película fina sobre portaobjetos de vidrio; autopsia o tejidos animales infectados, unte la lesión con un hisopo de algodón para tomar muestras. Para la preparación de colonias bacterianas o césped en medio sólido, primero use un asa de inoculación para tomar un anillo de solución salina normal y colóquelo en el centro del portaobjetos de vidrio, luego use un asa de inoculación estéril para tomar una pequeña cantidad de cultivo y triturar. Colóquelo uniformemente en solución salina normal, extiéndalo sobre una superficie recubierta de 1 cm2 y déjelo secar naturalmente a temperatura ambiente o lentamente a distancia.
2. El propósito de la fijación es matar bacterias, coagular las proteínas y estructuras bacterianas y facilitar la tinción; promover que las bacterias se adhieran al portaobjetos para evitar que sean arrastradas por el agua durante el lavado; cambia la permeabilidad de las bacterias a los tintes, lo que es beneficioso para la tinción de estructuras intracelulares bacterianas. Por lo general, se fija calentando con una llama y la mancha seca se pasa rápidamente a través de la llama 3 veces. Es mejor no quemar la piel del dorso de la mano cuando toca el portaobjetos.
3. Teñido Según los diferentes propósitos de inspección, elija diferentes métodos de teñido para teñir. Al teñir, agregue la solución de tinte gota a gota para aumentar la cobertura.
4. Mordiente Cualquier sustancia que pueda mejorar la afinidad entre el tinte y el objeto teñido, fijar el tinte en el objeto teñido y provocar un cambio en la permeabilidad de la membrana celular se llama mordiente. Se utilizan comúnmente alumbre, ácido tánico, sales metálicas y yodo, etc., y también se utiliza calentamiento para promover la coloración. Los mordientes se pueden usar entre la tinción primaria y la contratinción, y también se pueden usar después de la fijación o contenidos en el fijador y la tinción.
5. Decoloración Cualquier agente químico que pueda eliminar el color del objeto teñido se llama decolorante. Como decolorantes se utilizan habitualmente etanol, acetona, etc. El agente decolorante puede detectar el grado de estabilidad de la combinación de bacterias y tintes, que pueden usarse para tinciones diferenciales.
6. Contratinción Las bacterias o sus estructuras que han sido decoloradas a menudo se contratiñen con una solución de contratinción para facilitar la observación. El color de la solución de contratinción es diferente del de la solución de teñido primario para formar un fuerte contraste. La contratinción no debe ser demasiado fuerte para no tapar el color de la tinción inicial.
