En qué se diferencia la microscopía de fluorescencia de la microscopía convencional
Recientemente intenté hacer algunas secciones congeladas de ratones y ahora necesito usar un microscopio de fluorescencia para ver si el virus que inyecté está en el área cerebral deseada. Es necesario estudiar brevemente algunos principios básicos de la microscopía de fluorescencia y también los compartiré aquí.
El microscopio de fluorescencia utiliza luz ultravioleta como fuente de luz para iluminar el objeto que se está probando, lo que hace que el objeto emita una fuente de luz y luego observe el objeto bajo el microscopio. Utilizado principalmente para células de inmunofluorescencia, se compone de una fuente de luz, un sistema de placa de filtro y un sistema óptico para observar la imagen de fluorescencia de la muestra mediante la ampliación del ocular y la lente del objetivo. Echemos un vistazo a la diferencia entre este microscopio de fluorescencia y un microscopio óptico normal.
1. En cuanto a los métodos de iluminación.
El método de iluminación de un microscopio de fluorescencia generalmente utiliza un método de haz descendente, lo que significa que la fuente de luz se proyecta sobre la muestra de prueba a través de la lente del objetivo.
2. En términos de resolución
La microscopía de fluorescencia utiliza luz ultravioleta como fuente de luz, con una longitud de onda relativamente corta pero de mayor resolución que los microscopios ópticos comunes.
3. Diferencias en el filtro.
Un microscopio de fluorescencia utiliza dos filtros especiales, uno frente a la fuente de luz para filtrar la luz visible y el otro entre el objetivo y el ocular para filtrar la luz ultravioleta, que puede proteger los ojos.
La microscopía de fluorescencia también es un tipo de microscopio óptico, principalmente porque la longitud de onda excitada por la microscopía de fluorescencia es corta, lo que conduce a diferencias en la estructura y el uso de la microscopía de fluorescencia y la microscopía ordinaria. La mayoría de los microscopios de fluorescencia tienen la buena función de capturar luz débil, por lo que su capacidad de obtención de imágenes también es buena en condiciones de fluorescencia extremadamente débil. Además, con la mejora continua de la microscopía de fluorescencia en los últimos años, el ruido también se ha reducido significativamente. Por ello, cada vez se utilizan más microscopios de fluorescencia.
Conocimientos relacionados con la microscopía de fluorescencia de dos fotones.
El principio básico de la excitación de dos fotones es que, a una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber simultáneamente dos fotones de longitud de onda larga y, después de un corto período de vida del llamado estado excitado, emitir un fotón de longitud de onda más corta; Su efecto es el mismo que utilizar un fotón con una longitud de onda de la mitad de la longitud de onda larga para excitar moléculas fluorescentes. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones y, para evitar dañar las células, se utiliza un láser de pulso de modo bloqueado de alta energía en un microscopio de dos fotones. El láser emitido por este tipo de láser tiene una energía máxima alta y una energía promedio baja, con un ancho de pulso de sólo 100 femtosegundos y una frecuencia de hasta 80 a 100 megahercios. Cuando se utiliza un objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones de un láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal del objetivo es la más alta y la excitación de dos fotones sólo se produce en el punto focal del objetivo. Por lo tanto, un microscopio de dos fotones no requiere orificios confocales, lo que mejora la eficiencia de la detección de fluorescencia.
En los fenómenos de fluorescencia generales, debido a la baja densidad de fotones de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón fluorescente a través de una transición de radiación, lo que se denomina fluorescencia de fotón único. Para el proceso de excitación de fluorescencia que utiliza láser como fuente de luz, pueden ocurrir fenómenos de fluorescencia de dos fotones o incluso multifotónicos. En este momento, la fuente de luz de excitación utilizada es de alta intensidad y la densidad de fotones cumple con el requisito de que las moléculas fluorescentes absorban dos fotones simultáneamente. En el proceso de utilizar un láser típico como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para generar un fenómeno de absorción de dos fotones. Normalmente se utilizan láseres de pulso de femtosegundo y su potencia instantánea puede alcanzar el nivel de megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la de la excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación de longitud de onda de media excitación.
