¿Cómo puede elegir el microscopio confocal adecuado para usted? ¿Hay algún método específico?
La microscopía confocal tiene más ventajas que la microscopía de campo amplio. La microscopía confocal puede realizar cortes ópticos continuos de muestras y excluir la interferencia de señales de planos no focales. Por esta razón, la aplicación de la microscopía confocal es más común. Sin embargo, cada vez hay más microscopios confocales en el mercado. ¿Como escoger?
La microscopía confocal tiene más ventajas que la microscopía de campo amplio. La microscopía confocal puede hacer secciones ópticas continuas de muestras y excluir la interferencia de señales de planos no focales. Por esta razón, la microscopía confocal es más común. Sin embargo, cada vez hay más microscopios confocales en el mercado. ¿Como escoger? Al elegir un microscopio confocal, hay dos consideraciones básicas e importantes: el tipo de muestra que desea estudiar (p. ej., células fijas o vivas) y el tipo de ensayo que desea realizar (p. ej., procesos celulares estáticos o dinámicos).
Imágenes confocales de células fijas
Para obtener imágenes de células o tejidos fijados y teñidos, generalmente elegimos escaneo láser confocal (LSCM). Esto se debe principalmente a que las células muertas fijas carecen de eventos biológicos rápidos en las células vivas y pueden beneficiarse mejor de la mayor resolución espacial de LSCM. Las imágenes de LSCM son para cortar ópticamente la muestra con láser, y la velocidad de escaneo (dependiendo de la velocidad del espejo de la matriz de escaneo) es generalmente de 1 fps. Los tiempos de exposición más largos significan un mayor riesgo de fotoblanqueo, pero para las células muertas fijas, el tiempo no es crítico y podemos promediarlo tomando varias fotografías.
Imágenes confocales de células vivas
La obtención de imágenes de células vivas requiere protección adicional contra entornos hostiles. Cuando tomamos imágenes, nuestra primera consideración es mantener la viabilidad y la salud de las células. Los elementos de calentamiento a temperatura constante y los sistemas de perfusión son esenciales, especialmente para los estudios de lapso de tiempo. Los eventos bioquímicos rápidos que controlan el estado fisiológico de las células vivas son lo que la mayoría de la gente quiere estudiar, pero estos eventos son demasiado rápidos para la LSCM convencional. Además, la exposición prolongada a LSCM también indujo daños por luz tóxica en las células. Por lo tanto, la obtención de imágenes de células vivas requiere microscopios confocales especiales.
En general, existen dos opciones para obtener imágenes confocales de células vivas: confocales de escaneo láser de escaneo rápido y confocales de disco giratorio. La microscopía confocal de escaneo rápido reemplaza los espejos de galvanómetro más lentos con espejos de escaneo resonantes más rápidos, lo que permite velocidades de escaneo de hasta 30 fps; mientras que los confocales de disco giratorio (SDCM) tienen la ventaja de un escaneo más rápido (aunque inevitablemente con una pérdida de resolución espacial), su velocidad teóricamente puede alcanzar los 2000 fps (en la práctica, a menudo está limitada por otros factores).
Si le preocupa el fotoblanqueo o la señal de fluorescencia muy débil, SDCM puede ser más adecuado. SDCM utiliza dos discos giratorios con micropocillos dispuestos para dispersar la luz de excitación. A diferencia de LSCM, que escanea el punto de muestra, SDCM adquiere varios puntos a la vez (alrededor de 100 puntos de píxeles), por lo que la velocidad aumenta considerablemente y el fotoblanqueo de SDCM y menos fototoxicidad. Sin embargo, también puede usar confocales de escaneo rápido para aumentar la velocidad de escaneo, combinados con detectores altamente sensibles, y reducir la energía de la luz de excitación para reducir la fototoxicidad, lo que puede mantener las ricas funciones de los confocales tradicionales.
Sistema de imagen confocal automatizado
A algunos investigadores les gusta encontrar formas de modificar el microscopio para adaptarlo a sus necesidades individuales. Y algunos investigadores ni siquiera están interesados en cómo funcionan realmente los microscopios. Para estos últimos, un microscopio confocal automatizado puede ser más de su agrado. Por ejemplo, el Olympus FluoViewFV10i es un 4-microscopio láser confocal de escritorio totalmente automático. Su estructura integrada compacta casi no requiere espacio de instalación. Este tipo de instrumento es ideal para investigadores que necesitan realizar una gran cantidad de adquisición de datos de imágenes todos los días, pero, por supuesto, no reflejan completamente la funcionalidad y flexibilidad de los confocales tradicionales. Además, la NikonA1 también es un sistema confocal totalmente automático. Como la mayoría de los microscopios de barrido confocal convencionales, el NikonA1 utiliza un cabezal de barrido de galvanómetro, que tiene una resolución más alta que el A1R con un cabezal de barrido híbrido, pero una velocidad ligeramente más lenta (A1R ~30 fps)
