Observación de fluorescencia del microscopio óptico.
La fluorescencia se refiere al proceso en el que una sustancia fluorescente emite luz con una longitud de onda más larga casi simultáneamente cuando se irradia con luz de una longitud de onda específica (Figura 1). Cuando la luz de una longitud de onda específica (longitud de onda de excitación) golpea una molécula, como las de un fluoróforo, la energía del fotón es absorbida por los electrones de la molécula. A continuación, los electrones pasan del estado fundamental (S0) a un nivel de energía superior, el estado excitado (S1'). Este proceso se llama excitación①. El electrón permanece en el estado excitado durante 10-9–10-8 segundos, durante los cuales el electrón pierde algo de energía②. Durante el proceso en el que los electrones abandonan el estado excitado (S1) y regresan al estado fundamental③, se libera la energía restante absorbida durante el proceso de excitación.
Diagrama de Jablonski fluorescente
El tiempo de residencia de la molécula fluorescente en el estado excitado es el tiempo de vida de la fluorescencia, que generalmente está en el nivel de nanosegundos y es una característica inherente de la propia molécula fluorescente. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que utiliza tecnología de imágenes de vida útil de fluorescencia, puede realizar mediciones funcionales más detalladas además de imágenes de intensidad de fluorescencia y obtener la conformación molecular, las interacciones intermoleculares y el microentorno de las moléculas, etc. Información que es difícil de obtener con imágenes ópticas convencionales.
Otra propiedad importante de la fluorescencia es el desplazamiento de Stokes, la diferencia de longitud de onda entre los picos de excitación y emisión (Figura 2). Normalmente, la longitud de onda de emisión es más larga que la longitud de onda de excitación. Esto se debe a que los electrones perderán parte de su energía a través del proceso de relajación después de que la sustancia fluorescente se excite y antes de liberar fotones. Las sustancias fluorescentes con cambios de Stokes más grandes son más fáciles de observar bajo un microscopio de fluorescencia.
microscopio de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza las propiedades de la fluorescencia para la observación y la obtención de imágenes, y se utiliza ampliamente en diversos campos, como la biología celular, la neurobiología, la botánica, la microbiología, la patología y la genética. Las imágenes de fluorescencia tienen las ventajas de una alta sensibilidad y alta especificidad, y son muy adecuadas para la observación de la distribución de proteínas y orgánulos específicos en tejidos y células, el estudio de la colocalización y la interacción, el seguimiento de los procesos dinámicos de la vida, como los cambios en la concentración de iones. , etc.
La mayoría de las moléculas en las células no emiten fluorescencia, y si desea verlas, las etiqueta como fluorescentes. Existen muchos métodos de marcaje fluorescente, como el marcaje directo (como el uso de DAPI para marcar el ADN), o la inmunotinción que utiliza las propiedades de unión a antígenos de los anticuerpos, o el uso de proteínas fluorescentes (como GFP, proteína verde fluorescente) para marcar las proteínas diana. y encuadernación reversible. tintes sintéticos (como Fura-2), etc.
Microscopio de fluorescencia invertida MF53-N
En la actualidad, el microscopio de fluorescencia se ha convertido en el equipo de imagen estándar de varios laboratorios y plataformas de imagen, y es una buena ayuda para nuestros experimentos diarios. Los microscopios de fluorescencia se dividen principalmente en tres categorías: microscopios de fluorescencia verticales (adecuados para seccionamiento), microscopios de fluorescencia invertida (adecuados para células vivas, teniendo en cuenta el seccionamiento), estereoscopios fluorescentes (adecuados para muestras más grandes, como plantas, pez cebra (adulto/embrión) ), medaka, órganos de ratón/rata, etc.).
La tecnología de imágenes de microscopía de fluorescencia es ampliamente utilizada y rica en tipos, y todavía están surgiendo nuevas tecnologías. Puede elegir la tecnología para completar su propia investigación.
