Aplicación y uso del principio del microscopio de fluorescencia.
(1) El principio y las características estructurales del microscopio de fluorescencia: el microscopio de fluorescencia utiliza una fuente de luz puntual con alta eficiencia luminosa para emitir luz de una determinada longitud de onda (como luz ultravioleta de 3650 pulgadas o luz azul violeta de 4200 pulgadas) a través del sistema de filtro. como luz de excitación para excitar la muestra. Después de que la sustancia fluorescente del interior emite fluorescencia de varios colores, se observa a través del aumento de la lente del objetivo y el ocular. De esta manera, bajo un fondo de fuerte contraste, incluso si la fluorescencia es muy débil, es fácil de identificar y tiene una alta sensibilidad. Se utiliza principalmente para la investigación de la estructura y función celular y la composición química. La estructura básica de un microscopio de fluorescencia se compone de un microscopio óptico ordinario más algunos accesorios (como una fuente de luz fluorescente, un filtro de excitación, un divisor de haz de dos colores y un filtro de bloqueo, etc.). Fuente de luz fluorescente: generalmente utiliza una lámpara de mercurio de presión ultraalta (50-200W), que puede emitir luz de varias longitudes de onda, pero cada sustancia fluorescente tiene una longitud de onda de excitación que produce la fluorescencia más fuerte, por lo que se utiliza un filtro de excitación (generalmente, (hay filtros de excitación ultravioleta, violeta, azul y verde), que solo permiten que la luz de excitación de una determinada longitud de onda pase a través de la muestra e irradie, mientras absorbe otra luz. Después de irradiar cada sustancia con luz de excitación, emite fluorescencia visible con una longitud de onda más larga que la longitud de onda de irradiación en un tiempo muy corto. La fluorescencia es específica y generalmente más débil que la luz de excitación. Para observar la fluorescencia específica, se requiere un filtro de bloqueo (o supresión) detrás de la lente del objetivo. Tiene dos funciones: una es absorber y bloquear la luz de excitación para que no entre en el ocular, para no alterar la fluorescencia y dañar los ojos; la otra es seleccionar y dejar pasar la fluorescencia específica, mostrando un color fluorescente específico. Los dos filtros deben usarse juntos.
Existen dos tipos de microscopios de fluorescencia en cuanto a sus caminos ópticos:
1. Microscopio de fluorescencia de transmisión: la fuente de luz de excitación pasa a través del material de la muestra a través de una lente condensadora para excitar la fluorescencia. Generalmente se utiliza un colector de campo oscuro, y también se puede utilizar un colector ordinario para ajustar el espejo de modo que la luz de excitación se redirija y se desvíe hacia la muestra. Este es un microscopio fluorescente más antiguo. La ventaja es que la fluorescencia es fuerte con un aumento bajo, pero la desventaja es que la fluorescencia disminuye con el aumento del aumento. Por lo tanto, es mejor observar materiales de muestra más grandes.
2. El microscopio de epifluorescencia es un nuevo tipo de microscopio de fluorescencia desarrollado en los tiempos modernos. La diferencia es que la luz de excitación cae desde la lente objetivo a la superficie de la muestra, es decir, la misma lente objetivo se utiliza como condensador de iluminación y lente objetivo para recoger la fluorescencia. Es necesario agregar un divisor de haz dicroico en el camino de la luz, que está a 45 grados de distancia del uranio ligero. La luz de excitación se refleja en la lente del objetivo y se recoge en la muestra. La fluorescencia generada por la muestra y la luz de excitación reflejada por la superficie de la lente del objetivo y la superficie del cubreobjetos ingresan a la lente del objetivo al mismo tiempo y regresan al divisor de haz de dos colores para separar la luz de excitación de la fluorescencia. , la luz de excitación residual es absorbida por filtros de bloqueo. Como cambiar a una combinación de diferentes filtros de excitación/divisor de haz de dos colores/filtro de bloqueo, puede satisfacer las necesidades de diferentes productos de reacción fluorescentes. La ventaja de este tipo de microscopio de fluorescencia es que la iluminación del campo de visión es uniforme, la imagen es clara y cuanto mayor es el aumento, más fuerte es la fluorescencia.
(2) Cómo utilizar el microscopio de fluorescencia.
1. Encienda la fuente de luz y la lámpara de mercurio de presión ultraalta debe calentarse durante unos minutos para alcanzar el punto más brillante.
2. El microscopio de fluorescencia de transmisión necesita instalar el filtro de excitación requerido entre la fuente de luz y el condensador, e instalar el filtro de bloqueo correspondiente detrás de la lente objetivo. Los microscopios de epifluorescencia deben insertar el filtro de excitación/divisor de haz de dos colores/filtros de bloqueo necesarios en las ranuras del camino de la luz.
3. Observe con una lente de bajo aumento y ajuste el centro de la fuente de luz para que quede ubicado en el centro de todo el punto de iluminación de acuerdo con el dispositivo de ajuste de los diferentes modelos de microscopios de fluorescencia.
4. Coloque la pieza de muestra y observe después de enfocar. Se debe prestar atención durante el uso: no observar directamente con el filtro final, para no causar daños a los ojos; al observar muestras con una lente de aceite, se debe utilizar una lente de aceite especial sin fluorescencia; Después de apagar la lámpara de mercurio de alta presión, no se puede volver a encender inmediatamente y es necesario probarla. Se puede reiniciar después de 5 minutos; de lo contrario, será inestable y afectará la vida útil de la lámpara de mercurio.
(3) Observe las células teñidas con 0.01 por ciento de tinte fluorescente naranja de acridina bajo el microscopio fluorescente en la plataforma de enseñanza con un filtro de luz azul-violeta. El núcleo y el citoplasma se excitan para producir dos colores diferentes de fluorescencia (verde oscuro y rojo anaranjado).
