Características y aplicaciones de la microscopía láser confocal
El microscopio confocal de barrido láser (LSCM) es un tipo de microscopio diseñado en base a la tecnología de enfoque conjugado, es decir, para hacer que la fuente de luz láser, la muestra bajo prueba y el detector estén todos en la posición conjugada de cada uno.
Fundamental
En los microscopios generales, el plano focal de la lente del objetivo coincide con el detector, de modo que el plano de la imagen observada queda aislado del plano axial adyacente, mientras que en los microscopios confocales, la muestra se ilumina utilizando un punto de luz limitado por difracción, y en el Este efecto de aislamiento se logra mediante el uso de un orificio en la trayectoria de la luz de recolección en el punto focal del conjugado puntual para filtrar la luz parásita y mejorar la resolución.
Funciones de imagen
Solo la luz reflejada desde la capa de muestra conjugada puede pasar a través del pequeño orificio en la ruta de luz de recolección, y el pequeño orificio bloquea los reflejos irrelevantes restantes de la capa de muestra. Esto puede resultar en un aumento significativo en la resolución. A continuación se muestra una comparación en paralelo de la microscopía de fluorescencia multidimensional y la microscopía confocal de la misma muestra gruesa. Cuando se toma una serie de imágenes en diferentes planos focales, se puede generar lo que comúnmente se conoce como "pila z", y esta imagen muestra las ganancias de resolución y contraste que ofrece la microscopía confocal y las causas subyacentes de estas ganancias. El examen de la imagen en la parte superior de la pila con el plano de imagen por encima del tejido revela mucha luz dispersa en la imagen de fluorescencia, mientras que la imagen confocal aparece negra. Esta reducción de PSF en la dirección axial es directamente responsable de la diferencia de resolución observada en la interfaz óptica en el medio de la pila z.
Otra característica de la microscopía confocal de escaneo láser es que es una tecnología de escaneo de imágenes. La tecnología tradicional de iluminación de campo amplio ilumina toda la muestra, por lo que la imagen se puede capturar directamente a simple vista o con un detector, pero LSCM utiliza un haz o Múltiples haces enfocados pasan a través de la muestra para escanear y obtener imágenes, y la imagen resultante es llamada sección óptica. A continuación se muestra la diferencia entre el método tradicional de iluminación de campo amplio y el método de iluminación confocal de escaneo láser.
Por lo tanto, en la siguiente figura se muestra un método de trabajo práctico de un microscopio confocal moderno. La luz de excitación emitida por el láser pasa a través de un espejo dicroico y escanea en las direcciones x e y de la muestra a través de un par de espejos vibrantes. La excitación (o reflexión) de la muestra La luz ingresa al detector PMT a través del orificio y se registra, y la computadora reconstruye la imagen escaneada registrada para obtener la imagen real de la muestra.
