Diferencias entre los microscopios de fluorescencia y los microscopios ópticos comunes
Los microscopios de fluorescencia se diferencian de los microscopios ópticos convencionales. En lugar de observar muestras con luz de una fuente de luz ordinaria, utilizan luz de una longitud de onda específica (generalmente luz ultravioleta o azul violeta) para excitar sustancias fluorescentes dentro de la muestra en el portaobjetos del microscopio, lo que hace que estas sustancias emitan fluorescencia. Por tanto, la fuente de luz de un microscopio de fluorescencia no ilumina directamente la muestra; Actúa como fuente de energía para excitar las sustancias fluorescentes endógenas de la muestra. Podemos ver la muestra no debido a la iluminación de la propia fuente de luz, sino porque las sustancias fluorescentes dentro de la muestra absorben la energía luminosa de excitación y luego emiten fluorescencia.
De ello se deduce que la característica clave de un microscopio de fluorescencia es que su fuente de luz puede suministrar luz de excitación de una banda de longitud de onda específica, permitiendo que las sustancias fluorescentes en la muestra inspeccionada emitan fluorescencia de intensidad suficiente. Mientras tanto, un microscopio de fluorescencia debe estar equipado con el sistema de filtrado correspondiente. Es un instrumento esencial para la histoquímica de fluorescencia. Un microscopio de fluorescencia se compone principalmente de una fuente de luz de presión ultraalta, un sistema de filtro (incluidos filtros de excitación y filtros de barrera), un sistema óptico y un sistema fotográfico. Funciona utilizando luz de una longitud de onda específica para excitar sustancias fluorescentes.
① Métodos de excitación por fluorescencia Según el rango de longitud de onda de la luz de excitación, existen dos tipos: método de excitación UV (método de iluminación ultravioleta) y método de excitación BV (método de iluminación azul-violeta). El método de excitación UV utiliza luz ultravioleta de menos de 400 nm para la excitación. Genera fluorescencia invisible, por lo que la fluorescencia observada proviene de la propia muestra. Este método distingue fácilmente la fluorescencia específica de la autofluorescencia de fondo.
② Método de excitación BVEl método de excitación BV utiliza luz de excitación que va del violeta al azul centrada en 404 nm y 434 nm. Dado que se utiliza luz azul para irradiar la muestra, el sistema de filtro de excitación para este método debe bloquear completamente la luz azul y solo permitir el paso de la luz verde y amarilla requerida. Para la tinción con anticuerpos fluorescentes, la longitud de onda de absorción máxima de la luz de excitación está cerca de la longitud de onda de emisión máxima del tinte fluorescente. Por este motivo, el filtro configurado para la excitación BV debe utilizar un filtro de barrera de corte. Este método utiliza luz azul para la excitación, por lo que la eficiencia de recolección de fluorescencia es relativamente alta y se pueden obtener imágenes más brillantes. Su desventaja es que no se puede detectar la fluorescencia por encima de 500 nm y solo se pueden ver imágenes de color amarillo verdoso por encima de 500 nm. En la tinción con anticuerpos fluorescentes, el juicio sobre la especificidad depende en gran medida de la información del color, por lo que el inconveniente del método de excitación BV puede ser una limitación importante cuando se analiza la especificidad sutil.
