Diferencias y características entre el microscopio de fluorescencia y el microscopio óptico ordinario.
El microscopio de fluorescencia es diferente del microscopio óptico ordinario. No observa la muestra a través de la iluminación de una fuente de luz ordinaria. En cambio, utiliza luz de una determinada longitud de onda (normalmente luz ultravioleta, luz azul violeta) para excitar el material fluorescente de la muestra bajo el microscopio, provocando que emita fluorescencia. Por lo tanto, la fuente de luz de un microscopio de fluorescencia no sirve como iluminación directa, sino como fuente de energía que excita el material fluorescente interno de la muestra. La razón por la que podemos observar la muestra no se debe a la iluminación de la fuente de luz, sino al fenómeno de fluorescencia causado por el material fluorescente en la muestra que absorbe la energía luminosa excitada. Se puede ver que la característica principal de un microscopio de fluorescencia es que su fuente de luz puede suministrar una gran cantidad de luz de excitación en un rango de longitud de onda específico, de modo que las sustancias fluorescentes en la muestra examinada puedan obtener la intensidad necesaria de luz de excitación. Al mismo tiempo, los microscopios de fluorescencia deben disponer de los correspondientes sistemas de filtrado. La microscopía de fluorescencia es una herramienta esencial para la histoquímica de fluorescencia avanzada. Está compuesto por una fuente de luz de presión ultraalta, un sistema de filtro (incluidas placas de filtro de excitación y supresión), un sistema óptico y un sistema de fotografía. Utiliza luz de una determinada longitud de onda para excitar la muestra y emitir fluorescencia.
1. Formas de excitar la fluorescencia: según el rango de longitud de onda de la luz, se divide en dos tipos: método de excitación UV (utilizando el método de iluminación ultravioleta) y método de excitación BV (utilizando luz azul violeta). El método de excitación UV utiliza luz casi ultravioleta de menos de 400 nm para la excitación. No hay luz de excitación visible en este método, por lo que la fluorescencia observada muestra la fluorescencia inherente del tinte, lo que facilita distinguir la fluorescencia específica de la muestra de la autofluorescencia del tejido de fondo.
2. Método de excitación BV: excitación de luz ultravioleta a luz azul centrada en 404 nm y 434 nm. Este método utiliza luz azul para iluminar la muestra, por lo que el filtro de corte del sistema de observación de fluorescencia debe usar un filtro que pueda bloquear completamente la luz azul y pasar completamente la fluorescencia verde y amarilla requerida. Tintes fluorescentes utilizados en métodos de anticuerpos fluorescentes. La longitud de onda de absorción máxima de la luz de excitación y la longitud de onda de emisión máxima de la fluorescencia son relativamente cercanas, por lo que el filtro utilizado en el método de excitación BV debe utilizar un filtro de corte agudo. Este método puede utilizar luz azul como luz de excitación, por lo que la eficiencia de absorción de los pigmentos fluorescentes es mayor y se pueden obtener imágenes más brillantes. La desventaja es que no se puede ver la fluorescencia por debajo de 500 nm, mientras que la fluorescencia por encima de 500 nm hace que toda la imagen parezca amarilla. En el método de anticuerpos fluorescentes, la especificidad del tinte fluorescente se juzga principalmente por su color único. Por lo tanto, cuando se habla de especificidad sutil, las deficiencias mencionadas anteriormente del método de excitación BV a menudo tienen un gran impacto.
