Requisitos de preparación de muestras para microscopía de fluorescencia
Requisitos para la preparación de muestras para microscopía de fluorescencia
(1) portaobjetos de vidrio
El grosor del cristal del portaobjetos debe estar entre 0.8-L2mm. Un portaobjetos demasiado grueso absorberá más luz por un lado y no podrá enfocar la luz de excitación en la muestra por otro lado. Los portaobjetos deben ser lisos, de grosor uniforme y libres de autofluorescencia obvia. A veces se utilizan portaobjetos de cuarzo.
(2) cubierta de vidrio
El grosor de la cubierta de vidrio es de aproximadamente 0.17 mm, liso. Para fortalecer la luz de excitación, también se puede usar un cubreobjetos de interferencia, que es un cubreobjetos especial recubierto con varias capas de sustancias (como el fluoruro de magnesio) que tienen diferentes efectos de interferencia sobre la luz de diferentes longitudes de onda, lo que puede hacer que la fluorescencia suave. La luz de excitación pasa y la luz de excitación se refleja, y esta luz de excitación reflejada puede excitar la muestra.
(3) Muestra
Las rebanadas de tejido u otras muestras no deben ser demasiado gruesas. Si el grosor es demasiado grueso, la mayor parte de la luz de excitación se consumirá en la parte inferior de la muestra, mientras que la parte superior observada directamente por la lente del objetivo no podrá excitarse por completo. Además, la fluorescencia causada por la superposición de células o impurezas, la tinción no específica de fondo afecta el juicio.
(4) aceite de espejo
Generalmente, cuando se observan muestras con microscopios de fluorescencia de campo oscuro y microscopios de inmersión en aceite, se debe usar aceite de inmersión. Lo mejor es utilizar un aceite de inmersión especial no fluorescente. También se puede usar glicerina en su lugar, y también se puede usar parafina líquida, pero el índice de refracción es bajo, lo que tiene un ligero impacto en la calidad de la imagen.
Comprender el cubo de luz de la microscopía de fluorescencia
La fluorescencia es la luz que los electrones en una sustancia absorben energía luminosa de un estado de baja energía a un estado de alta energía, y luego liberan luz cuando regresa a un estado de baja energía. Es luz irradiada sin temperatura: luminiscencia. Es decir: la sustancia absorbe luz de onda corta, entra en estado de excitación y emite luz de onda larga.
Ya sea la autofluorescencia de la sustancia, el tinte fluorescente o la proteína fluorescente expresada por fusión, debe ser excitado por una longitud de onda de luz específica (excitación). Después de que los electrones migran y pierden energía, emiten luz de una longitud de onda larga específica (Emisión). , que puede ser recogido por el sistema de detección para lograr la función de identificar la fluorescencia específica.
¿Qué es un cubo de luz fluorescente?
En la observación e imagen del microscopio de fluorescencia, el cubo de luz de fluorescencia proporciona la luz de excitación de longitud de onda específica y la luz de emisión de longitud de onda larga correspondiente, de modo que la señal de fluorescencia se puede captar a simple vista, pantalla o cámara. Por lo tanto, el cubo de luz de fluorescencia determina lo que se puede detectar. El dispositivo clave de la señal de fluorescencia, sus características incluyen EX: parámetros de filtro de longitud de onda de excitación, EM: parámetros de filtro de longitud de onda de emisión y DM: parámetros de espejo dicotómico. Tome como ejemplo el cubo de luz DAPI del microscopio de fluorescencia integrado Revolve, EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >La luz de 425 nm se puede transmitir al EM; Los filtros de emisión EM se utilizan para separar la fluorescencia emitida por el fluoróforo de otros elementos ópticos de fondo para separar la luz. Los filtros de emisión transmiten luz en la longitud de onda de la fluorescencia a través del espejo dicroico mientras bloquean el resto de la luz que se escapa de la fuente de luz de excitación (reflejada por la muestra o la óptica). La longitud de onda de la luz emitida es mayor que la EM a observar, es decir, solo la luz dentro del rango de 450±25nm ingresa al sistema de detección. La selección adecuada de filtros EX, EM y dicotomías DM puede ayudar a los investigadores a lograr relaciones señal-ruido (S/N) más altas.
