Principios de la microscopía confocal láser (LSCM)
Un microscopio confocal láser utiliza un orificio de iluminación colocado detrás de la fuente de luz y un orificio de detección colocado frente al detector para lograr una iluminación puntual y una detección puntual. La luz de la fuente de luz se enfoca en un punto en el plano focal de la muestra mediante la luz emitida a través del orificio de iluminación, y la fluorescencia emitida desde ese punto se visualiza dentro del orificio de detección, y cualquier luz emitida fuera de ese punto es bloqueada por el agujero de detección. El orificio de iluminación y el orificio de detección están conjugados para el punto iluminado o detectado, de modo que el punto detectado es el punto confocal y el plano donde se ubica el punto detectado es el plano confocal. La computadora muestra el punto detectado en la pantalla de la computadora en forma de punto de imagen. Para producir una imagen completa, un sistema de escaneo en la trayectoria óptica escanea el plano focal de la muestra, produciendo así una imagen confocal completa. Mientras la plataforma portadora se mueve hacia arriba y hacia abajo a lo largo del eje Z, un nuevo nivel de la muestra se mueve al plano confocal y el nuevo nivel de la muestra se visualiza en el monitor, mientras el eje Z continúa. mover, se obtienen sucesivas imágenes cortadas con luz de diferentes niveles de la muestra.
El microscopio óptico tradicional utiliza una fuente de luz de campo; la imagen de cada punto de la muestra se verá interferida por la difracción o dispersión de la luz de los puntos vecinos; El microscopio confocal de barrido láser utiliza un rayo láser a través del orificio iluminado para formar una fuente de luz puntual en la muestra escaneada en cada punto del plano focal interno, la muestra en el punto irradiado, la imagen del orificio de detección, mediante la detección del orificio Después de recibir el punto del tubo de multiplicación de luz (PMT) o del dispositivo electroacoplado en frío (cCCD) punto por punto o línea por línea, se forma rápidamente una imagen fluorescente en la pantalla del monitor de la computadora. El orificio de iluminación y el orificio de detección en relación con el plano focal de la lente objetivo están conjugados, el punto en el plano focal al mismo tiempo se enfoca en el orificio de iluminación y el orificio de emisión, el punto fuera del plano focal no estará en la detección del agujero en la imagen, de modo que la imagen confocal obtenida sea la sección transversal óptica del espécimen, superando las deficiencias de la imagen borrosa del microscopio ordinario.
Desde el principio básico, el microscopio confocal láser es un microscopio óptico moderno, es el microscopio óptico ordinario a partir de la tecnología para realizar las siguientes mejoras.
1. Utilice láser como fuente de luz porque la monocromaticidad del láser es muy buena, la longitud de onda del haz de la fuente de luz es la misma, eliminando fundamentalmente la aberración cromática.
2. El uso de tecnología confocal en el plano focal de la lente objetivo colocada en el medio con un pequeño orificio en el deflector, el plano focal fuera del bloqueo de la luz parásita, eliminando la aberración esférica; Y eliminar aún más la aberración cromática.
3. Microscopio confocal láser que utiliza tecnología de escaneo puntual para descomponer la muestra en un espacio bidimensional o tridimensional en innumerables puntos, con un rayo láser muy pequeño (fuente de luz puntual) punto por punto, imágenes de escaneo línea por línea y luego a través la combinación de microcomputadora de un plano completo o una imagen tridimensional. El microscopio óptico tradicional es una fuente de luz de campo bajo la imagen de una sola vez, las muestras en cada punto de la imagen estarán adyacentes al punto de luz difractada y la interferencia de luz dispersa. La claridad y precisión de estas dos imágenes no se pueden comparar.
4. Adquisición y procesamiento de señales ópticas con ordenador y amplificación de las señales con tubo fotomultiplicador.
En el microscopio confocal láser, la computadora reemplaza al ojo humano o la cámara para la observación y grabación de video, y las imágenes obtenidas se digitalizan y pueden procesarse en la computadora para mejorar nuevamente la claridad de las imágenes. Además, el uso de tubos fotomultiplicadores puede amplificar señales muy débiles, mejorando enormemente la sensibilidad. Como resultado del uso combinado de las tecnologías anteriores, se puede decir que el LSCM es el microscopio más avanzado del mundo. Se puede decir que LSCM es la combinación de tecnología de producción de microscopios, tecnología fotoeléctrica y tecnología informática **, es el producto inevitable del desarrollo de la tecnología moderna.
