Principios de Microscopía Confocal
El microscopio confocal es un instrumento de imagen de alta precisión que surgió y se desarrolló en la década de 1980 y es un instrumento de investigación científica esencial para estudiar estructuras submicrónicas. Con el desarrollo de las computadoras, el software de procesamiento de imágenes y los láseres, los microscopios confocales también han experimentado un gran desarrollo y ahora se utilizan ampliamente en los campos de la biología, los microsistemas y la medición de materiales. El microscopio confocal es un nuevo tipo de microscopio que integra el principio confocal, la tecnología de escaneo y la tecnología de procesamiento de gráficos por computadora. Sus principales ventajas son: alta resolución lateral y alta resolución axial, y supresión efectiva de la luz parásita, con alto contraste.
Una configuración típica de un microscopio confocal consiste en colocar dos pequeños orificios en el plano conjugado del plano focal del objeto medido, uno de los cuales se coloca frente a la fuente de luz y el otro frente al detector, como se muestra en la figura. 1. Se puede ver en la figura que cuando la muestra medida está en el plano cuasi-foco, la intensidad de la luz recolectada por el extremo de detección es la más grande; cuando la muestra medida está en la posición desenfocada, el punto de luz en el extremo de detección se difunde y la intensidad de la luz disminuye rápidamente. Por lo tanto, solo la luz emitida por puntos en el plano focal puede pasar por el orificio de salida, mientras que la luz emitida por puntos fuera del plano focal está desenfocada en el plano del orificio de salida, y la mayoría de ellos no pueden pasar por el orificio central. Por lo tanto, el punto objetivo de observación en el plano focal aparece brillante y el punto de no observación aparece negro como fondo, aumentando el contraste y aclarando la imagen. Durante el proceso de formación de imágenes, los dos agujeros de alfiler son confocales, el punto confocal es el punto detectado y el plano donde se encuentra el punto detectado es el plano confocal.
El tamaño del agujero de alfiler en el detector en microscopía confocal juega un papel fundamental. Afecta directamente la resolución y la relación señal-ruido del sistema. Si el agujero de alfiler es demasiado grande, no se logrará el efecto de detección confocal, lo que no solo reduce la resolución del sistema, sino que también introduce más luz dispersa; si el agujero de alfiler es demasiado pequeño, reducirá la eficiencia de detección y reducirá la imagen microscópica. brillo. Los estudios han demostrado que cuando el diámetro del orificio es igual al diámetro del disco Airy, se cumplen los requisitos confocales y la eficiencia de detección no se reduce significativamente. Dado que el diámetro del agujero de alfiler es generalmente del orden de micras, si hay una desviación entre el punto de enfoque del rayo láser y la posición del agujero de alfiler, se producirá una distorsión de la señal. Por lo tanto, los microscopios confocales generalmente usan un sistema de enfoque automático, lo que aumenta virtualmente el tiempo de medición.
Dado que el microscopio de barrido confocal láser es un punto de imagen, para obtener una imagen bidimensional del objeto, es necesario utilizar un barrido bidimensional en las direcciones x e y. Diferentes microscopios utilizan diferentes métodos de escaneo:
(1) Escaneo de objetos. Es decir, el objeto en sí se mueve de acuerdo con cierta ley, mientras que el haz de luz permanece sin cambios. Ventajas: camino óptico estable; Desventajas: se requiere una mesa de escaneo grande, por lo que la velocidad de escaneo es muy limitada.
(2) Se forma un sistema de exploración de haz mediante el uso de un galvanómetro reflectante. Es decir, al controlar el galvanómetro de escaneo, el punto de luz enfocado se refleja regularmente en una determinada capa del objeto para completar el escaneo bidimensional. Su ventaja es que tiene una alta precisión y se usa a menudo para mediciones de alta precisión. La velocidad de escaneo ha mejorado con respecto al escaneo de objetos, pero aún no es rápida.
(3) Use el elemento de desviación acústico-óptico para escanear, y el escaneo se realiza cambiando la frecuencia de salida de la onda de sonido y luego cambiando la dirección de transmisión de la onda de luz. Su ventaja sobresaliente es que la velocidad de escaneo es muy rápida. El sistema de escaneo desarrollado por los Estados Unidos utiliza un deflector acústico-óptico para generar imágenes de video en tiempo real. Solo toma 1/30 s escanear una imagen bidimensional y casi logra una salida en tiempo real.
(4) Exploración del disco Nipkow. El proceso de escaneo se completa girando el disco Nipkow mientras se mantienen quietos otros componentes. Se puede visualizar a la vez y la velocidad es muy rápida. Sin embargo, dado que el haz de imágenes es luz fuera del eje, la aberración fuera del eje de la lente debe corregirse y la tasa de utilización de la energía luminosa es muy baja.
