Aplicación del concepto de microscopio moderno en la observación del mundo microscópico
Desde la antigüedad hasta el presente, los seres humanos han estado persiguiendo verdades más elevadas y lejanas. Desde viajes por mar hasta la exploración espacial, las personas han conquistado grandes objetivos uno tras otro. Sin embargo, el mundo macroscópico que la gente ve a simple vista no es el mundo entero, y el ojo humano no puede verlo con claridad. También atrae a innumerables personas para explorar y perseguir.
Independientemente de las cosas macroscópicas o microscópicas, nuestras observaciones se basan en los atributos del espacio tridimensional, es decir, tridimensional XYZ, y la observación de los cambios en la forma de las cosas necesita introducir otro factor de medición: el tiempo T, por lo que el La forma más completa de observar las cosas debe ser La grabación simultánea de XYZT, es decir, la fotografía a largo plazo de la forma más el tiempo, es también la función principal del microscopio.
Después de más de 300 años de desarrollo, los microscopios modernos han propuesto conceptos como resolución, profundidad de campo y campo de visión, y han propuesto soluciones continuamente. Los microscopios han satisfecho inicialmente nuestras necesidades de observación del mundo microscópico y nos han ayudado a registrar el espacio y el tiempo del mundo microscópico.
Lo más importante en la observación microscópica del mundo es la resolución de los detalles, y de ahí nació el concepto de resolución. La resolución se refiere a la distancia mínima entre dos puntos que puede distinguir el ojo humano, y solo es válida en la dimensión XY. Según el criterio de Rayleigh, Rayleigh Criterion, el límite que las personas normales pueden distinguir son dos puntos de 0.2mm a una distancia de 25cm. Cuando usamos un microscopio, podemos ver dos puntos a una distancia menor, lo que mejora la resolución de nuestra observación. Con la continua profundización de la investigación moderna, los requisitos de resolución de las personas también aumentan constantemente, y los científicos también mejoran constantemente la resolución de los microscopios. Por ejemplo, los microscopios electrónicos han aumentado la resolución al nivel nanométrico, lo que permite la observación de virus. La tecnología de imagen microscópica ultra alta mejora la resolución del microscopio de 200 nanómetros a decenas de nanómetros, realizando la observación de orgánulos de células vivas.
La mejora de la resolución también trae nuevos problemas, es decir, la reducción del campo de visión y la profundidad de campo. Cuando se usa el método de iluminación central ordinaria (el método de iluminación fotópica que hace que la luz pase uniformemente a través de la muestra), la distancia de resolución del microscopio es d=0.61 λ/NA, el rango de longitud de onda de la luz visible es { {2}}nm, la longitud de onda promedio es 550nm y la longitud de onda es una constante fija. Por lo tanto, al aumentar el valor NA se puede obtener un valor D más pequeño, es decir, la distancia entre dos puntos que se pueden distinguir más pequeños, lo que permite a las personas ver claramente los objetos más pequeños.
El valor NA es la apertura numérica, que describe el tamaño del ángulo del cono receptor de luz de la lente, NA=n * sin , es decir, el producto del índice de refracción (n) del medio entre la lente y el objeto a inspeccionar y el seno de la mitad del ángulo de apertura (2). n es el índice de refracción de la luz del medio entre la lente del objetivo y la muestra. Cuando el medio espacial del objeto del microscopio es el aire, el índice de refracción n=1. El uso de un medio con un índice de refracción más alto que el aire puede aumentar significativamente el valor de NA. El medio de inmersión en agua es agua destilada y el índice de refracción La relación es 1,33; el medio del objetivo de inmersión en aceite es aceite de cedro u otros aceites transparentes, y su índice de refracción es generalmente de alrededor de 1,52, que está cerca del índice de refracción de la lente y el portaobjetos. Por lo tanto, el valor NA de la lente de aceite es mayor que el de la lente de aire.
El ángulo de apertura, también conocido como "ángulo de la boca del espejo", es el ángulo formado por el punto del objeto en el eje óptico de la lente y el diámetro efectivo de la lente frontal de la lente del objetivo. Aumentar el ángulo de la boca del espejo puede aumentar el valor del seno, y su límite superior real es de aproximadamente 72 grados (el valor del seno es 0.95), multiplicado por el índice de refracción del aceite de cedro 1.52, se puede obtener que el El valor máximo de NA es de aproximadamente 1,45 y, sustituyéndolo en la fórmula de cálculo de resolución, se puede obtener que la resolución límite del plano XY de un microscopio convencional es de aproximadamente 0,2um.
El valor NA también afecta directamente el brillo del campo de visión del microscopio (B). De la fórmula B∝NA2/M2 podemos deducir que el brillo aumenta con el aumento de la apertura numérica (NA) o la disminución del aumento de la lente del objetivo (M).
Teóricamente, deberíamos buscar el valor NA más alto posible para obtener una mejor resolución del plano XY y brillo del campo de visión. Sin embargo, todo tiene dos caras. La mejora de la resolución del plano XY reducirá la profundidad de campo del eje Z y el campo de visión de observación.
Los microscopios generalmente ven la vista verticalmente hacia abajo. Cuando la posición convexa y la posición cóncava en la superficie del objeto observado dentro del diámetro del campo de visión se pueden ver claramente, entonces la diferencia de altura entre el punto convexo y el punto cóncavo es la profundidad de campo. Bueno, para los microscopios, cuanto mayor sea la profundidad de campo, mejor. Cuanto mayor sea la profundidad de campo, mejores y más claras imágenes tridimensionales se pueden obtener al observar la superficie de objetos irregulares. La gran profundidad de campo nos ayuda a observar el mundo microscópico en dirección vertical. Es decir, la información del eje Z en forma tridimensional XYZ.
La profundidad de campo es la profundidad del espacio frontal y posterior correspondiente a la imagen clara en el plano de la imagen: dtot=(λ*n)/NA más n/(M∗NA) * e, dtot: profundidad de campo , NA: apertura numérica, M: Ampliación total, λ: longitud de onda de la luz (generalmente λ=0.55um), n: índice de refracción del medio entre la muestra y la lente del objetivo (aire: n{{3 }}, aceite: n=1.52) Según esta fórmula, podemos saber que la profundidad de campo del eje Z es inversamente proporcional al valor NA del plano XY.
Además de la profundidad de campo, el campo de visión también se ve afectado por el valor NA. El rango espacial que se puede ver cuando el instrumento mira fijamente a un punto es el campo de visión. Su cálculo está directamente relacionado con el aumento de la lente del objetivo. El diámetro real del campo de visión visto por observación es igual al diámetro del campo de visión. Dividido por el aumento de la lente del objetivo, el ocular indicará el campo de visión correspondiente, como 10/18, es decir, el el aumento es de 10 veces y el diámetro del campo de visión es de 18 mm. Por lo tanto, cuando se determina el ocular, cuanto mayor sea el aumento, menor será el campo de visión observado.
La resolución del plano XY es el análisis de los detalles locales, y el campo de visión determina nuestro rango de observación de la muestra. Cuanto mayor sea el campo de visión, mejor, pero limitado por la tecnología actual, debemos usar lentes objetivo de alta potencia para obtener buenos valores de NA, por lo tanto, el campo visual y los valores de NA tienen una correlación negativa indirecta.
