¿Por qué necesita un microscopio confocal?
1. Después de los esfuerzos y mejoras de nuestros grandes predecesores, el microscopio óptico ha alcanzado el punto de perfección. De hecho, los microscopios comunes pueden brindarnos bellas imágenes microscópicas de manera simple y rápida. Sin embargo, ocurrió un evento que trajo una innovación revolucionaria a este mundo de microscopios casi perfecto, que es la invención del "microscopio confocal de barrido láser". La característica de este nuevo tipo de microscopio es que adopta un sistema óptico que solo extrae la información de la imagen en la superficie donde se concentra el foco, y restaura la información obtenida en la memoria de la imagen mientras cambia el foco, para que la información 3D completa pueda ser obtenido. Una imagen descarnada de inteligencia. Con este método, es posible obtener fácilmente información sobre la forma de la superficie que no se puede confirmar con un microscopio normal. Además, para los microscopios ópticos ordinarios, "resolución creciente" y "profundidad de enfoque más profunda" son condiciones contradictorias, especialmente a grandes aumentos, esta contradicción es más prominente, pero en términos de microscopios confocales, este problema se resuelve fácilmente.
2. Ventajas del sistema óptico confocal
El sistema óptico confocal realiza una iluminación puntual en la muestra, y el receptor puntual también recibe la luz reflejada. Cuando la muestra se coloca en la posición de enfoque, casi toda la luz reflejada puede llegar al fotorreceptor, y cuando la muestra está desenfocada, la luz reflejada no puede llegar al fotorreceptor. Es decir, en el sistema óptico confocal sólo se emitirá la imagen que coincida con el punto focal y se apantallarán los puntos de luz y la luz dispersa inútil.
3. ¿Por qué usar láser?
En el sistema óptico confocal, la muestra se ilumina en un punto y la luz reflejada también es recibida por un fotorreceptor puntual. Por lo tanto, se hace necesaria una fuente de luz puntual. Los láseres son fuentes de luz muy puntuales. En la mayoría de los casos, las fuentes de luz láser se utilizan como fuentes de luz para microscopios confocales. Además, las características de monocromaticidad, direccionalidad y excelente forma de haz del láser también son razones importantes para su amplia adopción.
4. Se hace posible la observación en tiempo real basada en el escaneo de alta velocidad
Para el escaneo láser, la dirección horizontal adopta el deflector óptico acústico (elemento AO), y la dirección vertical adopta el espejo de escaneo de haz controlado electrónicamente servo (espejo servo-galvano). Dado que la unidad de deflexión acústico-óptica no tiene una parte de vibración mecánica, puede realizar un escaneo de alta velocidad y es posible la observación en tiempo real en la pantalla del monitor. Esta imagen de alta velocidad es un elemento muy importante que afecta directamente la velocidad de enfoque y la recuperación de la posición.
5. La relación entre la posición de enfoque y el brillo
En el sistema óptico confocal, el brillo de la muestra es máximo cuando la muestra se coloca correctamente en la posición focal, y su brillo disminuirá bruscamente antes y después (la línea continua en la Figura 4). La selectividad sensible del plano focal es también el principio de la determinación de la dirección de la altura del microscopio confocal y la expansión de la profundidad focal. Por el contrario, los microscopios ópticos ordinarios no tienen cambios de brillo evidentes antes y después de la posición de enfoque.
6. Alto contraste, alta resolución
En los microscopios ópticos ordinarios, debido a la interferencia de la luz reflejada en la parte de enfoque, se superpone con la parte de imagen de enfoque, lo que da como resultado una disminución en el contraste de la imagen. En cambio, en el sistema óptico confocal, la luz dispersada fuera del punto focal y la luz dispersada dentro de la lente del objetivo se eliminan casi por completo, por lo que se puede obtener una imagen con un contraste muy alto. Además, debido a que la luz pasa dos veces a través de la lente del objetivo, la imagen puntual se agudiza primero, lo que también mejora el poder de resolución del microscopio.
7. Función de localización óptica
En el sistema óptico confocal, la luz reflejada distinta del punto coincidente con el punto focal está protegida por el microporo. Por lo tanto, al observar una muestra tridimensional, se forma una imagen como si la muestra estuviera cortada con el plano focal. Este efecto se conoce como localización óptica y es una de las especialidades de los sistemas ópticos confocales.
8. Función de memoria móvil de enfoque
La llamada luz reflejada fuera del punto focal está protegida por los microporos. Por otro lado, se puede considerar que todos los puntos de la imagen formada por el sistema óptico confocal coinciden con el punto focal. Por lo tanto, si la muestra tridimensional se mueve a lo largo del eje Z (eje óptico), las imágenes se acumulan y almacenan en la memoria, y finalmente se obtendrá la imagen formada por toda la muestra y el punto focal. La función de profundizar infinitamente la profundidad de enfoque de esta manera se denomina función de memoria móvil.
9. Función de medición de la forma de la superficie
En cuanto a la función de cambio de enfoque, la forma de la superficie de la muestra se puede medir sin contacto agregando un circuito de registro de la altura de la superficie. Con base en esta función, es posible registrar las coordenadas del eje Z formadas por el valor máximo de luminancia en cada píxel, y en base a esta información, se puede obtener información relacionada con la forma de la superficie de la muestra.
10. Función de medición de tamaño micro de alta precisión
La unidad de recepción de luz adopta un sensor de imágenes CCD 1-dimensional, por lo que no se ve afectado por la inclinación de escaneo del dispositivo de escaneo, por lo que se puede completar una medición de alta precisión. Además, debido al uso de la función de memoria de cambio de enfoque con profundidad de enfoque ajustable (profundización), se puede eliminar el error de medición causado por el cambio de enfoque.
11. Análisis de imágenes tridimensionales
Con la función de medición de la forma de la superficie, puede crear fácilmente una imagen tridimensional de la superficie de la muestra. No solo eso, sino que también puede realizar una variedad de análisis tales como: medición de rugosidad superficial, área, volumen, área superficial, circularidad, radio, longitud máxima, perímetro, centro de gravedad, imagen tomográfica, transformación FFT, medición de ancho de línea, etc. .
El microscopio de barrido confocal láser se puede utilizar no solo para observar la morfología celular, sino también para el análisis cuantitativo de los componentes bioquímicos intracelulares, las estadísticas de densidad óptica y la medición de la morfología celular.
