¿Por qué necesitamos la microscopía confocal?
1. Tras los esfuerzos y mejoras de nuestros grandes predecesores, el microscopio óptico ha alcanzado un nivel perfecto. De hecho, los microscopios normales pueden proporcionarnos hermosas imágenes microscópicas de forma sencilla y rápida. Sin embargo, ocurrió un hecho que trajo una innovación revolucionaria a este casi perfecto mundo de los microscopios, que fue la invención del "microscopio confocal de barrido láser". La característica de este nuevo tipo de microscopio es que adopta un sistema óptico que extrae información de la imagen únicamente en la superficie donde se concentra el foco. Al cambiar el enfoque y restaurar la información obtenida en la memoria de imágenes, se pueden obtener imágenes vívidas con completa inteligencia de información 3D. Mediante este método, se puede obtener fácilmente información sobre la forma de la superficie que no puede confirmarse con microscopios convencionales. Además, para los microscopios ópticos típicos, "resolución creciente" y "profundidad focal cada vez mayor" son condiciones contradictorias, especialmente con grandes aumentos. Sin embargo, en los microscopios confocales este problema se resuelve fácilmente.
2. Ventajas de los sistemas ópticos confocales
El sistema óptico confocal se utiliza para la iluminación puntual de la muestra y la luz reflejada también es recibida por un sensor puntual. Cuando la muestra se coloca en la posición focal, casi toda la luz reflejada puede llegar al sensor. Cuando la muestra se desvía del punto focal, la luz reflejada no puede llegar al sensor. Es decir, en un sistema óptico confocal solo se emitirá la imagen que coincida con el foco, y se apantallará el punto y la luz dispersada inútil.
¿Por qué utilizar láser?
En los sistemas ópticos confocales, se aplica iluminación puntual a la muestra y la luz reflejada también es recibida por un sensor puntual. Por lo tanto, las fuentes de luz puntuales se han vuelto necesarias. El láser es una fuente de luz muy puntual. En la mayoría de los casos, la fuente de luz de la microscopía confocal es el láser. Además, la monocromaticidad, la direccionalidad y la excelente forma del haz de los láseres también son razones importantes para su adopción generalizada.
4. Se hace posible la observación en tiempo real basada en escaneo de alta velocidad
El escaneo láser utiliza un reflector óptico acústico (AO) en dirección horizontal y un espejo Servo Galvano en dirección vertical. Debido a la ausencia de vibraciones mecánicas en la unidad de polarización óptica de audio, es posible realizar un escaneo de alta velocidad y observar en tiempo real en la pantalla de monitoreo. La alta velocidad de este tipo de cámaras es un factor muy importante que incide directamente en la velocidad de enfoque y recuperación de la posición.
5. La relación entre posición focal y brillo.
En un sistema óptico confocal, cuando la muestra se coloca correctamente en la posición focal, el brillo es alto y el brillo disminuye drásticamente antes y después (línea continua en la Figura 4). La selectividad sensible de este plano focal es precisamente el principio detrás de la determinación de la dirección de la altura y la expansión de la profundidad focal en microscopía confocal. En comparación, los microscopios ópticos típicos no muestran cambios de brillo significativos antes y después de la posición focal (línea de puntos en la Figura 4).
6. Alto contraste y resolución
Un microscopio óptico típico, debido a la interferencia causada por la luz reflejada que se desvía del punto focal, se superpone con la parte focal de la imagen, lo que resulta en una disminución del contraste de la imagen. Por el contrario, en los sistemas ópticos confocales, la luz dispersada fuera del foco y la luz dispersada dentro de la lente del objetivo se eliminan casi por completo, obteniendo así imágenes con un contraste muy alto. Además, debido a que la luz pasa dos veces a través de la lente del objetivo, la imagen puntual se vuelve más nítida primero, lo que también mejora la resolución del microscopio.
