¿Qué es la microscopía de fluorescencia de dos fotones?
El principio básico de la excitación de dos fotones es: en el caso de una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo y emitir un fotón de longitud de onda más corta después de un breve período de vida del llamado estado excitado. . ; el efecto es el mismo que usar un fotón cuya longitud de onda es la mitad de la longitud de onda larga para excitar una molécula fluorescente. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones. Para no dañar las células, la microscopía de dos fotones utiliza láseres pulsados de modo bloqueado de alta energía. El láser emitido por este láser tiene un pico de energía alto y un promedio de energía bajo, su ancho de pulso es de solo 100 femtosegundos y su frecuencia puede alcanzar de 80 a 100 megahercios. Cuando se usa una lente de objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente del objetivo es la más alta, y la excitación de dos fotones solo ocurre en el punto focal de la lente del objetivo, por lo que el microscopio de dos fotones no necesita un agujero de alfiler confocal, lo que mejora la eficiencia de detección de fluorescencia.
En general, los fenómenos de fluorescencia, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón fluorescente a través de una transición radiativa, que es la fluorescencia de un solo fotón. Para el proceso de excitación de fluorescencia que usa láser como fuente de luz, puede ocurrir una fluorescencia de dos fotones o incluso de múltiples fotones. En este momento, la intensidad de la fuente de luz de excitación utilizada es alta y la densidad de fotones cumple con los requisitos de las moléculas fluorescentes que absorben dos fotones al mismo tiempo. En el proceso de usar un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para producir el fenómeno de absorción de dos fotones. Habitualmente se utiliza un láser pulsado de femtosegundos, y su potencia instantánea puede alcanzar el orden de los megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la longitud de onda de la luz de excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación a la mitad de la longitud de onda de excitación.
