La microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene muchas ventajas:
1) Las longitudes de onda de luz más largas se ven menos afectadas por la dispersión que las longitudes de onda de luz más cortas para penetrar la muestra;
(2) Las moléculas fluorescentes fuera del plano focal no se excitan para que pueda llegar más luz de excitación al plano focal, de modo que la luz de excitación pueda penetrar más profundamente en la muestra;
3) Las longitudes de onda más largas de la luz infrarroja cercana son menos tóxicas para las células que las longitudes de onda más cortas;
4) Cuando se utiliza un microscopio de dos fotones para observar una muestra, el fotoblanqueo y la fototoxicidad están presentes sólo en el plano focal. Por lo tanto, los microscopios de dos fotones son más adecuados que los microscopios de fotón único para observar muestras gruesas, observar células vivas o realizar experimentos de fotoblanqueo puntual.
Conocimiento del microscopio de fluorescencia confocal.
El principio básico del microscopio de fluorescencia confocal: se utiliza una fuente de luz puntual para irradiar la muestra, formando un punto de luz pequeño y bien definido en el plano focal. La fluorescencia emitida desde este punto después de la irradiación es recogida por la lente del objetivo y enviada de regreso al divisor de haz que consiste en un espejo cromático bidireccional a lo largo de la trayectoria de la luz de irradiación original. El divisor de haz envía la fluorescencia directamente al detector. Tanto la fuente de luz como el detector tienen cada uno un orificio delante de ellos, llamado orificio de iluminación y orificio de detección, respectivamente. Ambos tienen la misma geometría, aproximadamente 100-200 nm, y son conjugados con respecto al punto de luz en el plano focal, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y finalmente puede enfocarse tanto en el punto de iluminación y poros del detector. De esta manera, la luz del plano focal puede converger dentro de la apertura de la sonda, mientras que la luz dispersada desde arriba o debajo del plano focal queda bloqueada fuera de la apertura de la sonda y no puede ser fotografiada. El láser escanea la muestra punto por punto, y el tubo fotomultiplicador después de detectar el orificio también obtiene la imagen confocal de la luz correspondiente punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora, y finalmente converge en una imagen clara. Imagen confocal de todo el plano focal en la pantalla.
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra, y esta sección transversal óptica siempre tiene un cierto espesor, también conocida como lámina óptica. Dado que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que la del punto no focal, y la luz del plano no focal es filtrada por el orificio, la profundidad de campo del sistema confocal se aproxima a cero, y el escaneo a lo largo de la dirección del eje Z permite que la tomografía óptica forme un corte óptico bidimensional de la muestra que se observará en el punto focal. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), se puede obtener una imagen tridimensional de la muestra acumulando capas sucesivas de imágenes bidimensionales, que se procesan mediante software informático especializado.
Esto significa que el orificio de detección y el orificio de la fuente de luz siempre están enfocados en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano focal no puede entrar en el orificio de detección.
El principio de funcionamiento del láser confocal se expresa simplemente en que utiliza láser como fuente de luz, sobre la base de imágenes de microscopio de fluorescencia tradicional, un dispositivo de escaneo láser adicional y un dispositivo de enfoque conjugado, a través de control por computadora para llevar a cabo el sistema de adquisición y procesamiento de imágenes digitales.
