La microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene muchas ventajas.
1) La luz de longitud de onda larga se ve menos afectada por la dispersión que la luz de longitud de onda corta y puede penetrar fácilmente en la muestra;
2) Las moléculas fluorescentes fuera del plano focal no se excitan, lo que permite que llegue más luz de excitación al plano focal, lo que permite que la luz de excitación penetre en muestras más profundas;
3) La luz del infrarrojo cercano de longitud de onda larga es menos tóxica para las células que la luz de longitud de onda corta;
4) Al observar muestras utilizando un microscopio de dos fotones, el fotoblanqueo y la fototoxicidad ocurren solo en el plano focal. Por lo tanto, los microscopios de dos fotones son más adecuados que los microscopios de fotón único para observar muestras gruesas, observar células vivas o realizar experimentos de fotoblanqueo de punto fijo.
Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia confocal.
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal: utilice una fuente de luz puntual para iluminar la muestra y formar un punto de luz pequeño y bien definido en el plano focal. La fluorescencia emitida por el punto después de ser iluminado es recogida por la lente del objetivo y devuelta al espejo dicroico a lo largo de la trayectoria de la luz de iluminación original. constituyen un divisor de haz. El espectrómetro envía la fluorescencia directamente al detector. Hay un orificio delante de la fuente de luz y el detector, que se denominan orificio de iluminación y orificio de detección, respectivamente. Las dimensiones geométricas de los dos son consistentes, aproximadamente 100-200nm; En relación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y, en última instancia, puede enfocarse en el orificio de iluminación y el orificio de detección al mismo tiempo. De esta manera, la luz del plano focal se puede concentrar dentro del orificio de detección, mientras que la luz dispersada desde arriba o debajo del plano focal queda bloqueada fuera del orificio de detección y no se puede visualizar. La muestra se escanea punto por punto con el láser, y el tubo fotomultiplicador detrás del orificio de detección también obtiene la imagen confocal de la luz correspondiente punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora, y finalmente se agrega. en la pantalla en una imagen confocal clara de todo el plano focal. .
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra. Esta sección transversal óptica siempre tiene un espesor determinado y también se denomina sección óptica delgada. Dado que la intensidad de la luz en el foco es mucho mayor que la intensidad de la luz en el no foco, y la luz del plano no focal es filtrada por el orificio, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero. El escaneo a lo largo de la dirección del eje Z puede realizar una tomografía óptica, formando la sección óptica bidimensional deseada en el punto enfocado de la muestra. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), acumulando niveles continuos de imágenes bidimensionales y procesándolas con software informático especializado, se puede obtener una imagen tridimensional de la muestra.
Es decir, el orificio de detección y el orificio de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano de enfoque no puede entrar en el orificio de detección.
La expresión simple del principio de funcionamiento del láser confocal es que utiliza láser como fuente de luz. Sobre la base de las imágenes de microscopio de fluorescencia tradicionales, se agregan un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado, y el sistema es controlado por una computadora para recolectar y procesar imágenes digitales.
