El principal método de observación del microscopio óptico es la observación de fluorescencia.
La fluorescencia se refiere al proceso en el que una sustancia fluorescente emite luz con una longitud de onda más larga casi simultáneamente cuando se irradia con luz de una longitud de onda específica (Figura 1). Cuando la luz de una longitud de onda específica (longitud de onda de excitación) golpea una molécula, como las de un fluoróforo, la energía del fotón es absorbida por los electrones de la molécula. A continuación, los electrones pasan del estado fundamental (S0) a un nivel de energía superior, el estado excitado (S1'). Este proceso se llama excitación①. El electrón permanece en el estado excitado durante 10-9–10-8 segundos, durante los cuales el electrón pierde algo de energía②. Durante el proceso en el que los electrones abandonan el estado excitado (S1) y regresan al estado fundamental③, se libera la energía restante absorbida durante el proceso de excitación.
El tiempo de residencia de la molécula fluorescente en el estado excitado es el tiempo de vida de la fluorescencia, que generalmente está en el nivel de nanosegundos y es una característica inherente de la propia molécula fluorescente. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que utiliza la tecnología de imágenes de fluorescencia de por vida, se denomina imagen de fluorescencia de por vida (FLIM). Además de las imágenes de intensidad de fluorescencia, se pueden obtener mediciones funcionales y precisas más profundas para obtener la conformación molecular, las interacciones intermoleculares y el microambiente de las moléculas. Información que es difícil de obtener con imágenes ópticas convencionales.
Otra propiedad importante de la fluorescencia es el desplazamiento de Stokes, la diferencia de longitud de onda entre los picos de excitación y emisión (Figura 2). Normalmente, la longitud de onda de emisión es más larga que la longitud de onda de excitación. Esto se debe a que los electrones perderán parte de su energía a través del proceso de relajación después de que la sustancia fluorescente se excite y antes de liberar fotones. Las sustancias fluorescentes con cambios de Stokes más grandes son más fáciles de observar bajo un microscopio de fluorescencia.
Microscopía de fluorescencia y cubos de filtros de fluorescencia
El microscopio de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza las propiedades de la fluorescencia para la observación y la obtención de imágenes, y se utiliza ampliamente en diversos campos, como la biología celular, la neurobiología, la botánica, la microbiología, la patología y la genética. Las imágenes de fluorescencia tienen las ventajas de una alta sensibilidad y alta especificidad, y son muy adecuadas para la observación de la distribución de proteínas y orgánulos específicos en tejidos y células, el estudio de la colocalización y la interacción, el seguimiento de los procesos dinámicos de la vida, como los cambios en la concentración de iones. , etc.
La mayoría de las moléculas en las células no emiten fluorescencia, y para verlas deben estar marcadas con fluorescencia. Existen muchos métodos de marcaje fluorescente, como el marcaje directo (como el uso de DAPI para marcar el ADN), o la inmunotinción que utiliza las propiedades de unión a antígenos de los anticuerpos, o el uso de proteínas fluorescentes (como GFP, proteína verde fluorescente) para marcar las proteínas diana. y encuadernación reversible. Tintes sintéticos (como Fura-2) y así sucesivamente.
En la actualidad, el microscopio de fluorescencia se ha convertido en el equipo de imagen estándar de varios laboratorios y plataformas de imagen, y es una buena ayuda para nuestros experimentos diarios. Los microscopios de fluorescencia se dividen principalmente en tres categorías: microscopios de fluorescencia verticales (adecuados para rebanar), microscopios de fluorescencia invertida (adecuados para células vivas, teniendo en cuenta el corte), estereoscopios fluorescentes (adecuados para muestras más grandes, como plantas, pez cebra (adulto/embrión) ), medaka, órganos de ratón/rata, etc.).
El bloque de filtro de fluorescencia es el componente central de las imágenes de fluorescencia del microscopio. Consta de tres partes: filtro de excitación, filtro de emisión y divisor de haz dicroico. Se instala en la rueda de filtros. Por ejemplo, Leica DMi8 está equipado con una rueda de filtro de posición 6-(Fig. 3). El número de posiciones de las diferentes ruedas del microscopio será diferente, y algunos microscopios usan portaobjetos de bloque de filtro.
El bloque de filtro juega un papel importante en la formación de imágenes de fluorescencia: el filtro de excitación selecciona la luz de excitación para excitar la muestra y bloquea la luz de otras longitudes de onda; la luz que pasa por el filtro de excitación pasa por el espejo dicroico (su función es reflejar la luz de excitación y transmitir la fluorescencia), después de la reflexión, es enfocada por la lente objetivo, irradia la muestra, y excita la fluorescencia correspondiente, es decir , luz emitida. La luz emitida es recogida por la lente del objetivo, pasa a través del divisor de haz dicroico y llega al filtro de emisión. Como se muestra en la Figura 4: la longitud de onda de excitación es 450-490nm, el espejo dicroico refleja luz de menos de 510nm, transmite luz de más de 510nm y el rango de recepción de la luz emitida es de 520-560nm.
