El principal método de observación del microscopio óptico es la observación de fluorescencia.
Fenómeno de fluorescencia
La fluorescencia se refiere al proceso en el que una sustancia fluorescente emite luz con una longitud de onda más larga casi simultáneamente cuando se irradia con luz de una longitud de onda específica (Figura 1). Cuando la luz de una longitud de onda específica (longitud de onda de excitación) golpea una molécula (como una molécula en un fluoróforo), la energía del fotón es absorbida por los electrones de la molécula. A continuación, los electrones pasan del estado fundamental (S0) a un nivel de energía superior, el estado excitado (S1'). Este proceso se llama excitación①. El electrón permanece en el estado excitado durante 10-9–10-8 segundos, durante los cuales el electrón pierde algo de energía ②. En el proceso de salir del estado excitado (S1) y volver al estado fundamental ③, se liberará la energía restante absorbida durante el proceso de excitación.
El tiempo de residencia de una molécula fluorescente en estado excitado es el tiempo de vida de la fluorescencia, generalmente en nanosegundos, que es una característica inherente de la propia molécula fluorescente. La tecnología de generación de imágenes que utiliza la vida útil de la fluorescencia se llama Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), que puede realizar mediciones funcionales y precisas más profundas además de imágenes de intensidad de fluorescencia para obtener conformación molecular, interacciones intermoleculares y microambientes moleculares. información que es difícil de obtener con imágenes ópticas convencionales.
Otra propiedad importante de la fluorescencia es el desplazamiento de Stokes, la diferencia de longitud de onda entre los picos de excitación y emisión (Figura 2). Por lo general, la longitud de onda de la luz de emisión es más larga que la longitud de onda de la luz de excitación. Esto se debe a que después de excitar la sustancia fluorescente y antes de que se libere el fotón, los electrones perderán una parte de la energía a través del proceso de relajación. Las sustancias fluorescentes con cambios de Stokes más grandes son más fáciles de observar bajo un microscopio de fluorescencia.
Microscopios de fluorescencia y bloques de filtros de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia es un microscopio óptico que utiliza las propiedades de la fluorescencia para observar y generar imágenes, y se usa ampliamente en biología celular, neurobiología, botánica, microbiología, patología, genética y otros campos. Las imágenes de fluorescencia tienen las ventajas de una alta sensibilidad y alta especificidad, y son muy adecuadas para la observación de la distribución de proteínas específicas, orgánulos, etc. en tejidos y células, el estudio de la colocalización y la interacción, y el seguimiento de la dinámica de la vida. procesos tales como cambios en la concentración de iones.
La mayoría de las moléculas en las células no emiten fluorescencia y, para poder verlas, deben estar marcadas con fluorescencia. Hay muchos métodos de marcaje fluorescente, que se pueden marcar directamente (como usar DAPI para marcar el ADN), o inmunotinción usando las propiedades de unión a antígeno de los anticuerpos, o la proteína diana se puede marcar con proteínas fluorescentes (como GFP, green proteína fluorescente), o unión reversible. tintes sintéticos (como Fura-2), etc.
En la actualidad, el microscopio de fluorescencia se ha convertido en el equipo de imagen estándar de varios laboratorios y plataformas de imagen, y es una buena ayuda para nuestros experimentos diarios. Los microscopios de fluorescencia se dividen principalmente en tres categorías: microscopios de fluorescencia verticales (adecuados para seccionar), microscopios de fluorescencia invertida (adecuados para células vivas, teniendo en cuenta las secciones), microscopios estereoscópicos de fluorescencia (adecuados para muestras más grandes, como plantas, pez cebra (adulto/ embrión), medaka, órganos de ratón/rata, etc.).
El bloque de filtro de fluorescencia es el componente central de las imágenes de fluorescencia en los microscopios. Consta de un filtro de excitación, un filtro de emisión y un divisor de haz dicroico. Se instala en la rueda de filtros, como la Leica DMi8 equipada con una rueda de filtros de 6-posición (Figura 3). ). Diferentes microscopios tienen diferentes posiciones de rueda, y algunos microscopios usan portaobjetos de filtro.
El bloque de filtro juega un papel importante en la formación de imágenes de fluorescencia: el filtro de excitación selecciona la luz de excitación para excitar la muestra y bloquea otras longitudes de onda de luz; la luz que pasa a través del filtro de excitación pasa a través de un divisor de haz dicroico (su función es reflejar la luz de excitación y transmitir la fluorescencia), después de la reflexión, la lente del objetivo la enfoca, la irradia a la muestra y la fluorescencia correspondiente se excita para emitir luz. La luz emitida es recogida por la lente del objetivo, pasa a través del divisor de haz dicroico y llega al filtro de emisión. Como se muestra en la Figura 4: la longitud de onda de excitación es 450-490nm, el divisor de haz dicroico refleja luz de menos de 510nm, transmite luz de más de 510nm y el rango de recepción de la luz de emisión es de 520-560nm.
Los filtros de fluorescencia comúnmente utilizados en los microscopios de fluorescencia se pueden dividir en dos tipos: paso largo (LP para abreviar) y paso de banda (BP para abreviar). El paso de banda suele estar determinado por la longitud de onda central y el ancho del intervalo, como 480/40, lo que significa que se puede pasar luz de 460-500nm. Los filtros de paso largo, como el 515 LP, dejan pasar luz con longitudes de onda superiores a 515 nm (Figura 5).
Las sustancias fluorescentes tienen su curva de excitación (absorción) característica y su curva de emisión, el pico de excitación es la longitud de onda de excitación ideal (alta eficiencia de excitación, que puede reducir la energía de la luz de excitación, proteger las células y los colorantes), y la curva de emisión es la longitud de onda de fluorescencia de emisión rango. Por lo tanto, en el experimento, elegiremos la longitud de onda lo más cerca posible del pico de excitación para la excitación, y el rango de recepción debe incluir el pico de emisión. Por ejemplo, el pico de excitación de Alexa Fluor 488 es de 500 nm y el filtro de excitación de 480/40 se puede seleccionar en el microscopio de fluorescencia.
Los detalles de los cubos de filtro se pueden ver en el software de imágenes del microscopio. Comprender los tintes y encontrar el filtro que mejor se adapte a su muestra es fundamental para las imágenes de fluorescencia. La información espectral de los tintes fluorescentes y las proteínas fluorescentes generalmente se indica en las instrucciones y también se puede encontrar en línea.
Además de las longitudes de onda de excitación y emisión de las sondas fluorescentes, la selección de bloques de filtros también debe tener en cuenta si existe una excitación no específica y si existe un color cruzado para las muestras etiquetadas con varios colores. Además, es necesario considerar la fuente de luz fluorescente utilizada. En la actualidad, las fuentes de luz fluorescente comúnmente utilizadas incluyen lámparas de mercurio, lámparas de halogenuros metálicos y fuentes de luz LED que se han desarrollado rápidamente en los últimos años. El espectro de una fuente de luz fluorescente es continuo o discontinuo, y la energía será diferente en diferentes bandas de longitud de onda. La fuente de luz LED se está convirtiendo gradualmente en la principal fuente de luz del microscopio de fluorescencia debido a su banda espectral relativamente estrecha, salida de energía más estable, larga vida útil, protección ambiental más segura y muchas otras ventajas.
Además del bloque de filtro incorporado del microscopio, también hay una rueda rápida externa (Figura 7). La velocidad de conversión del filtro adyacente a la rueda rápida externa de Leica es de 27 ms, que puede realizar experimentos multicolores de alta velocidad, como imágenes de calcio con relación FRET y Fura2. (Fig. 8) et al.
Una amplia variedad de técnicas de imagen de microscopía de fluorescencia
Para satisfacer las diferentes necesidades de imágenes de fluorescencia, además de los microscopios de fluorescencia, se han desarrollado varias soluciones de imágenes de microscopía de fluorescencia:
Los sistemas de imágenes de alta definición de campo amplio, como Leica THUNDER Imager, utilizan la innovadora tecnología Clearing de Leica para eliminar de manera eficiente las señales de interferencia del plano no focal durante la obtención de imágenes, presentando imágenes claras y las ventajas de las imágenes de alta velocidad;
El microscopio de barrido láser confocal utiliza orificios para eliminar la interferencia del plano no focal, realiza cortes ópticos y obtiene imágenes de alta definición e imágenes tridimensionales;
Los microscopios y nanomicroscopios de ultra alta resolución que superan el límite de difracción pueden observar estructuras finas de menos de 200 nm;
Un sistema de imágenes multifotónicas que utiliza el principio de excitación multifotónica para obtener imágenes de tejido grueso y profundo in vivo;
Tecnología de imágenes de láminas de luz con alta resolución temporal y espacial, alta velocidad de imágenes, alta resolución, baja fototoxicidad, especialmente adecuada para la investigación sobre el desarrollo y la observación dinámica in vivo;
Las imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM), que no se ven afectadas por factores como la concentración de sustancias fluorescentes, el fotoblanqueo, la intensidad de la luz de excitación, etc., pueden realizar mediciones funcionales y precisas más profundas;
La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS) y la espectroscopia de correlación cruzada de fluorescencia (FCCS) miden el número molecular y el coeficiente de difusión de las moléculas fluorescentes, analizando así la concentración molecular, el tamaño molecular, la viscosidad, el movimiento molecular, la unión/disociación molecular y las propiedades ópticas moleculares;
La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF), con una resolución del eje z extremadamente alta, es ideal para estudiar la estructura molecular y la dinámica de las superficies de las membranas celulares.
