La diferencia entre el contraste de fase positivo y negativo en un microscopio.
Según la configuración y la naturaleza del anillo de fase colocado en el plano focal posterior del objetivo, las muestras se pueden observar en contraste de fase positivo o negativo. Este tutorial interactivo estudia la relación entre el sonido envolvente (S), la difracción (D) y las partículas brillantes resultantes (ondas P), así como la microscopía de contraste de fase positiva y negativa. Además, también se presentan la geometría de la placa de fase y las imágenes de muestra representativas.
Cuando las personas lo usan en su trabajo ahora, la mayoría de los investigadores están en la diferencia negativa, y ahora la diferencia positiva no juega un papel importante en el trabajo de investigación científica actual.
El tutorial inicializa la imagen de fase con una muestra seleccionada aleatoriamente que aparece en la ventana Imagen de contraste de fase, y la relación de onda correspondiente se muestra en el lado izquierdo de la ventana de imagen. Para operar el tutorial, use el cursor del mouse para mover la traducción entre el contraste de fase positivo y negativo o el control deslizante del modo de contraste de fase de iluminación brillante. Cuando se traslada el control deslizante, las imágenes que aparecen en la ventana de imagen de contraste de fase cambian la apariencia de la muestra en el modo de imagen actual establecido por el control deslizante. Además, debajo del gráfico de forma de onda hay una placa de fase que cambia de forma para coincidir con el modo de imagen seleccionado por el control deslizante. Para ver una nueva muestra, utilice el menú desplegable Muestra seleccionada para seleccionar otra muestra.
En la Figura 1 se presenta un gráfico de la configuración de la placa de fase, las relaciones de onda y los vectores asociados con la generación de imágenes de contraste de fase positivo y negativo. También se muestran ejemplos de especímenes captados por estas técnicas. En una configuración óptica de contraste de fase positivo (fila superior de la imagen en la Figura 1), el frente de onda envolvente (S) pasa a través de la placa de fase, lo que resulta en un cambio de fase neto de 180 grados de avance de fase, por 1/4 de longitud de onda ( 1 media longitud de onda). Los frentes de onda envolventes avanzados ahora pueden participar en interferencias destructivas con ondas difractadas (D) en el plano de imagen intermedio. En la mayoría de los casos, el simple avance de la fase relativa del frente de onda circundante no es suficiente para generar imágenes de alto contraste en los microscopios Nikon. Esto se debe a que la amplitud de las ondas envolventes es significativamente mayor que la de las ondas difractadas y suprime la imagen resultante producida por la interferencia de una fracción del número total de ondas. Para reducir el frente de onda circundante a un valor más cercano a la amplitud de las ondas difractadas (y realizar interferencia en el plano de la imagen), la opacidad en el anillo de fase del objetivo se obtiene aplicando un metal semitransparente (neutro de densidad creciente). ) piso de revestimiento. Las ondas de luz circundantes, que pasan casi completamente a través del anillo de fase por diseño, bajo microscopía de contraste de fase, se reducen significativamente en amplitud por la opacidad de la placa de fase a un valor en el rango de 10 a 30 por ciento de la intensidad original.
Debido a que la onda de partículas resultante es producida por la interferencia* de los frentes de onda circundantes y difractados, la amplitud de la onda de partículas (P) producida por la interferencia entre los frentes de onda que llegan al plano de la imagen es ahora mucho más pequeña que la circundante cuando está en Sexual recubrimiento de densidad aplicado. El efecto neto es convertir la diferencia de fase relativa introducida por el paso de la luz que emerge del plano de la imagen a través del espécimen en una diferencia de amplitud (intensidad). Debido a que el ojo humano interpretará la diferencia de intensidad como un contraste, la muestra ahora es visible en el ocular del microscopio y también se puede capturar en la membrana con sistemas de cámara convencionales o digitalmente, usando dispositivos CCD o CMOS. Todos los sistemas de contraste de fase positiva avanzan selectivamente la fase del frente de onda envolvente lineal (S) en relación con el frente de onda difractado esférico (D). Los especímenes con un índice de refracción más alto que el medio circundante aparecen más oscuros sobre un fondo gris neutro, mientras que aquellos con un índice de refracción más bajo que el medio flotante aparecen más brillantes que el fondo gris.
Para modificar la separación espacial de los frentes de onda difractados que rodean la fase y la amplitud en un sistema óptico de contraste de fase, se han introducido varias configuraciones de placas de fase. Debido a que la placa de fase está ubicada en o muy cerca del plano focal posterior del objetivo (plano de difracción), toda la luz que pasa a través del microscopio debe viajar a través de este componente. La parte de la placa de fase en su foco anular del condensador se denomina región conjugada, mientras que la región restante se denomina región complementaria. La región conjugada contiene el material responsable de cambiar la fase de la luz circundante (no difractada) en más o menos 90 grados con respecto al frente de onda difractado. En general, el área del anillo de fase conjugada es más ancha (alrededor del 25 por ciento) que el área definida por la imagen del anillo de condensación para reducir la cantidad de luz circundante que se propaga al área complementaria.
La mayoría de las placas de fase disponibles de los fabricantes de microscopios modernos son de las que se preparan mediante deposición al vacío de películas finas dieléctricas y metálicas sobre una placa de vidrio o se montan directamente sobre la superficie de la lente del objetivo del microscopio. El papel de la película dieléctrica es desfasar la luz, mientras que la película de metal atenúa la intensidad de la luz no difractada. Algunos fabricantes utilizan varios revestimientos antirreflectantes combinados con la película para reducir la cantidad de deslumbramiento y el reflejo de la luz parásita en el sistema óptico. Si la placa de fase no se forma en la superficie de una lente, generalmente se cementa entre lentes sucesivas que residen en el plano focal cerca de la parte trasera del objetivo. El grosor y el índice de refracción de los revestimientos dieléctrico, metálico y antirreflectante, así como los del cemento óptico, se eligen cuidadosamente para producir el cambio de fase deseado entre las regiones complementaria y conjugada de la placa de fase. En términos ópticos, una placa de fase que cambia la fase relativa a la luz circundante para difractar la luz en 90 grados (ya sea positiva o negativa) se denomina placa de cuarto de onda debido al efecto de diferencia de camino óptico sobre ella.
En la Figura 1 se muestra una descripción general de la inversa de fase positiva. La placa de contraste de fase positiva (lado izquierdo de la Figura 1) impulsa la onda envolvente, en 1/4 de longitud de onda, debido al anillo de erosión en la placa de vidrio, que puede ser reducido por el paso superior en la placa de alto índice El camino físico de onda tomado. Debido a la interacción con la muestra, cuando los rayos de muestra difractados (D) se retardan, la diferencia de camino óptico entre las ondas difractadas y envolventes que emergen de la placa de fase es la mitad de la longitud de onda por 1/4 de longitud de onda. El resultado neto es una diferencia de camino óptico de 180-grados entre las ondas circundantes y las difractadas, lo que resulta en una interferencia destructiva para muestras de alto índice de refracción entre los planos de la imagen. La curva de amplitud para la fase positiva opuesta a la onda de interferencia destructiva se muestra en el gráfico superior de la Figura 1. La onda de partículas (P) resultante tiene una amplitud más baja que la onda envolvente (S), lo que hace que el objeto parezca comparado con una onda relativamente fondo más oscuro. Abajo, imagen del alga verde Zygnema que se muestra a la derecha (etiquetada como DL). El vector representado por el progreso de 1/4 de longitud de onda, que se muestra como una onda envolvente giratoria en sentido antihorario de 90-grados en contraste de fase positivo, aparece entre la figura y la imagen en la Figura 1.
Alternativamente, la óptica del microscopio también se puede fabricar para producir una fase negativa opuesta, como se muestra en la parte inferior de la Figura 1, en cuyo caso las ondas envolventes (S) se retrasan (en lugar de avanzar) en un cuarto de longitud de onda relativo en la onda difractada (D). Como resultado, las muestras con índices de refracción altos aparecen más brillantes sobre un fondo gris más oscuro (vea la imagen inferior etiquetada como BM en la Figura 1). En la fase opuesta negativa, la placa de fase objetivo contiene un anillo elevado que retarda la fase (en lugar de avanzar la fase como la fase opuesta positiva), pasando un cuarto de longitud de onda en relación con la fase de la onda difractada como la onda envolvente de orden cero. Debido a que las ondas difractadas se han retrasado un cuarto de longitud de onda cuando pasan a través de la muestra, la diferencia de camino óptico entre las ondas circundantes y difractadas se elimina y la muestra de alto índice de refracción interfiere constructivamente en el plano de la imagen. Tenga en cuenta que la onda de la partícula resultante (P) tiene una amplitud mayor que la onda envolvente (S) en contraste de fase negativo. También se muestra una inversión de fase negativa, donde el vector de onda de circunnavegación pasa a través de una rotación de 90 grados en el sentido de las agujas del reloj del diagrama vectorial.
