Características técnicas y habilidades de uso del microscopio de fluorescencia de dos fotones.
La microscopía de fluorescencia de dos fotones es una nueva tecnología que combina la microscopía confocal de barrido láser y la tecnología de excitación de dos fotones.
El principio básico de la excitación de dos fotones es: en el caso de una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo y emitir un fotón de longitud de onda más corta después de un breve período de vida del llamado estado excitado. . ; El efecto es el mismo que usar un fotón con una longitud de onda la mitad de la longitud de onda larga para excitar una molécula fluorescente. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones. Para no dañar las células, la microscopía de dos fotones utiliza láseres pulsados de modo bloqueado de alta energía. El láser emitido por este láser tiene un pico de energía alto y un promedio de energía bajo, su ancho de pulso es de solo 100 femtosegundos y su período puede alcanzar de 80 a 100 megahercios. Cuando se usa una lente de objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente del objetivo es la más alta, y la excitación de dos fotones solo ocurre en el punto focal de la lente del objetivo, por lo que el microscopio de dos fotones no necesita un agujero de alfiler confocal, lo que mejora la eficiencia de detección de fluorescencia. Es un método de investigación importante en los campos de la morfología, la biología celular molecular, la neurociencia y la farmacología.
1. Los antecedentes del surgimiento de la microscopía de dos fotones: dos limitaciones de la microscopía confocal láser tradicional:
1) Uno es el fenómeno de la fototoxicidad: debido a que el orificio confocal debe ser lo suficientemente pequeño para obtener una imagen de alta resolución, y la pequeña apertura bloqueará una gran parte de la fluorescencia emitida por la muestra, incluida la fluorescencia emitida por el plano focal, el correspondiente Sí, la luz de excitación debe ser lo suficientemente fuerte para obtener una relación señal/ruido suficiente; y el láser de alta intensidad hará que el tinte fluorescente se desvanezca rápidamente durante el escaneo continuo, y la señal fluorescente se volverá más y más débil a medida que avanza el escaneo.
2) La fototoxicidad es otro problema. Bajo la irradiación láser, muchas moléculas de tinte fluorescente producirán citotoxinas como oxígeno singulete o radicales libres, por lo que el tiempo de escaneo y la densidad de potencia óptica de la luz de excitación deben limitarse en el experimento para mantener la densidad de la muestra. activo. En la investigación sobre muestras activas, especialmente las diversas etapas del crecimiento y desarrollo de muestras activas, el fotoblanqueo y la fototoxicidad hacen que estos estudios sean muy limitados.
2. ¿Por qué dice que los microscopios de dos fotones generalmente no necesitan estar equipados con láseres de excitación ultravioleta?
La microscopía de dos fotones es una tecnología de excitación de fluorescencia basada en el efecto de excitación de dos fotones: las moléculas de tinte fluorescente pueden excitarse absorbiendo dos fotones de baja energía al mismo tiempo (el intervalo de tiempo entre dos fotones que alcanzan las moléculas fluorescentes es inferior a 1 femtosegundo ), su efecto de excitación puede ser equivalente a absorber un fotón de alta energía de 1/2 longitud de onda. Por ejemplo, absorber dos fotones en longitudes de onda rojas es equivalente a que una molécula absorba ultravioleta. Las células no absorben fácilmente los fotones de longitud de onda larga, por lo que se reduce la fototoxicidad para las células vivas y también se reduce el fotoblanqueo. De esta manera, no solo cumple la función de excitación ultravioleta, sino que también evita el daño de la luz ultravioleta a la muestra.
3. ¿Qué tiene de especial el láser del microscopio de dos fotones?
La probabilidad de absorción de dos fotones depende de cuán cerca coincidan los dos fotones incidentes en el espacio y el tiempo (los dos fotones deben llegar en 10-18 segundos). La sección transversal de absorción de dos fotones es pequeña y solo se excitan los fluoróforos en regiones con un gran flujo de fotones. Por lo tanto, la mayoría de los láseres utilizados son láseres de zafiro de titanio, que pueden alcanzar velocidades de exploración de picosegundos o femtosegundos, y tienen una potencia máxima muy alta y una potencia media baja, por lo que el fotoblanqueo y la fototoxicidad pueden reducirse o eliminarse. Lo más importante es proporcionar una densidad muy alta de fotones en un rango pequeño, lo que puede garantizar la excitación simultánea de dos fotones.
4. ¿Cuáles son las ventajas de la excitación de dos fotones?
1) Aumentar la selectividad del colorante: el rango de luz de excitación del láser del sistema confocal (Ar, Ar/Kr, HeNe) es de 488nm - 647nm. Esto significa experimentar con tintes fluorescentes excitados por UV, por ejemplo, con DAPI, Hoescht. La longitud de onda de excitación de dos fotones es el doble que la de un solo fotón, por lo que los tintes excitados por el ultravioleta pueden excitarse por la luz del infrarrojo cercano.
2) Reducir el fotoblanqueo: debido a la reducción del fotoblanqueo, aumenta la tasa de éxito de los experimentos que utilizan CFP/YFP para la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).
3) No se requiere lente de objetivo especial: desde el punto de vista del hardware, la excitación de colorantes excitados por UV con la longitud de onda de la luz infrarroja cercana no requiere componentes ópticos UV especiales.
4) Mejorar la relación señal-ruido: la longitud de onda de la luz de excitación y la longitud de onda de la luz emitida tienen una gran diferencia, lo que mejora la relación señal-ruido.
5) Blanqueamiento localizado en el punto focal: dado que la excitación de la fluorescencia ocurre solo en el punto focal del objetivo, no hay necesidad de un agujero de alfiler confocal. Esto mejora la detección de luz y el fotoblanqueo ocurre solo en el punto focal.
6) Especímenes más fáciles de penetrar: las células no dispersan fácilmente la luz de longitud de onda infrarroja y pueden penetrar especímenes más profundos.
5. En comparación con la microscopía confocal de barrido láser, ¿cuál es la mayor mejora realizada por la microscopía de dos fotones?
1) Fotoblanqueo reducido.
2) Fototoxicidad reducida.
3) No es fácil de dispersar y es más fácil penetrar muestras gruesas, como cortes de cerebro.
