Técnicas de tinción y observación microscópica de microorganismos.
1. Propósito
1.1 Aprender las técnicas básicas de frotis y tinción microbiana.
1.2 Dominar el método sencillo de tinción de bacterias.
1.3 Comprender preliminarmente las características morfológicas de las bacterias, y consolidar los conocimientos sobre el uso de lentes de aceite y técnicas de funcionamiento aséptico.
2 principios
Untar y teñir bacterias es una técnica básica en experimentos de microbiología. Las células bacterianas son pequeñas y transparentes, lo que las hace difíciles de identificar con un microscopio óptico común; deben estar manchados. Se utiliza un solo tinte para teñir las bacterias, de modo que las bacterias teñidas formen una clara diferencia de color con respecto al fondo, de modo que su morfología y estructura se puedan observar más claramente. Este método es fácil de operar y adecuado para observar la forma general de las células bacterianas y la disposición de las bacterias. Los tintes básicos se utilizan comúnmente para tinciones simples. Esto se debe a que en soluciones neutras, alcalinas o débilmente ácidas, las células bacterianas suelen estar cargadas negativamente, y cuando los tintes básicos se ionizan, la parte teñidora de sus moléculas está cargada positivamente, por lo que son alcalinas. La parte colorante del tinte se combina fácilmente con las bacterias para colorearlos. Las células bacterianas teñidas contrastan marcadamente con el fondo, lo que las hace más fáciles de identificar bajo el microscopio. Los tintes comúnmente utilizados para teñidos simples incluyen azul de metileno, violeta cristal, fucsina básica, etc. Cuando las bacterias descomponen los azúcares y producen ácido, lo que hace que el pH del medio de cultivo baje, la carga positiva de las bacterias aumenta. En este momento, se pueden utilizar tintes ácidos como eosina, fucsina ácida o rojo Congo para teñir. Las bacterias deben fijarse antes de teñir. Tiene dos propósitos: uno es matar las bacterias y hacer que se adhieran al portaobjetos de vidrio; el otro es aumentar su afinidad por los tintes. Dos métodos comúnmente utilizados son el calentamiento y la fijación química. Al arreglar, trate de mantener la forma original de las celdas.
3 materiales
3.1 Bacterias: cultivo inclinado en agar nutritivo de Bacillus subtilis 12-18h, cultivo inclinado en agar nutritivo de 24 horas de Staphylococcus aureus, cultivo inclinado en agar nutritivo de 24 horas de Escherichia coli, cultivo inclinado en agar de levadura de panadería.
3.2 Agente colorante: tinte azul de metileno alcalino de Lu (o tinte violeta cristal de oxalato de amonio), tinte de fucsina de ácido carbólico.
3.3 Instrumentos u otros utensilios: microscopio, lámpara de alcohol, portaobjetos, asa de inoculación, rejilla para portaobjetos, frasco de doble capa (que contiene aceite de cedro y xileno), pañuelo para lentes, solución salina fisiológica o agua destilada, etc.
4. Proceso: frotis → secado → fijación → tinción → lavado → secado → examen microscópico.
5 pasos
5.1 Frotis: Tome dos portaobjetos de vidrio limpios y sin aceite. En condiciones estériles, coloque una pequeña gota de solución salina normal (o agua destilada) en cada centro del portaobjetos de vidrio. Utilice un asa de inoculación para esterilizar las bacterias de Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus y Escherichia coli, recoja un poco de césped bacteriano en las gotas de agua en la pendiente, mezcle bien y aplíquelo en una película delgada. Si utiliza un frotis de suspensión bacteriana (o cultivo líquido), puede utilizar un asa de inoculación para seleccionar de 2 a 3 asas y aplicarlas directamente sobre el portaobjetos. Tenga cuidado de no dejar caer demasiada solución salina fisiológica (agua destilada) y elimine las bacterias y aplíquelo de manera uniforme y no demasiado espesa.
5.2 Secado Secar naturalmente a temperatura ambiente. También puedes calentarlo ligeramente sobre una lámpara de alcohol con el lado recubierto hacia arriba para secarlo. Pero asegúrese de no acercarse demasiado a la llama, ya que una temperatura demasiado alta destruirá la morfología de las bacterias.
5.3 Fijación Si se utiliza secado con calor, la fijación y el secado se combinan en un solo paso y el método es el mismo que el secado. Untar, secar y fijar con calor.
5.4 Tinción: Coloque el portaobjetos plano sobre la gradilla y agregue de 1 a 2 gotas de solución de tinte sobre el frotis (es apropiado que la solución de tinte cubra apenas la película de frotis). Teñir con azul de metileno básico de Lu durante 1 a 2 minutos y teñir con fucsina de ácido carbólico (o cristal violeta de oxalato de amonio) durante aproximadamente 1 minuto.
5.5 Lavado con agua: Retire la solución de tinte y enjuague suavemente con agua del grifo desde un extremo del portaobjetos hasta que el agua que baja del frotis sea incolora. Cuando lave con agua, no lave la superficie recubierta directamente con agua. El flujo de agua no debe ser demasiado rápido ni demasiado grande para evitar que se caiga la película de frotis.
5.6 Secado: Sacuda las gotas de agua del portaobjetos y séquelo de forma natural, séquelo con secador de pelo o absorba con papel absorbente (tenga cuidado de no limpiar las bacterias). 5.7 Examen microscópico Después de que el frotis esté seco, realice un examen microscópico. El frotis debe estar completamente seco antes de observarlo con una lente de aceite.
6 Resultados Dibuje la morfología de E. coli y Micrococcus luteus observada después de una tinción única.
