Técnicas de tinción y observación microscópica de microorganismos.
Tinción simple de bacterias
1 Objetivos
1.1 Conocer las técnicas básicas de frotis y tinción microbiana.
1.2 Dominar el método sencillo de tinción de bacterias.
1.3 Conocer las características morfológicas de las bacterias, y consolidar el aprendizaje del uso del espejo de aceite y técnicas de operación aséptica.
2 Principio El frotis y tinción de bacterias es una técnica básica en los experimentos de microbiología. Las células de las bacterias son pequeñas y transparentes, no son fáciles de reconocer con el microscopio óptico común y deben teñirse. El uso de un solo tinte para teñir las bacterias, de modo que el organismo teñido y el fondo formen una diferencia de color clara, de modo que su morfología y estructura se puedan observar más claramente. Este método es fácil de realizar y adecuado para observar la forma general del organismo y la disposición de las bacterias. Los tintes alcalinos se usan comúnmente para tinciones simples, porque en soluciones neutras, alcalinas o débilmente ácidas, las células bacterianas generalmente están cargadas negativamente, y cuando los tintes alcalinos se ionizan, la porción de tinción de sus moléculas está cargada positivamente, por lo que la porción de tinción de los tintes alcalinos Puede unirse fácilmente a las bacterias para colorearlas. Las células bacterianas teñidas contrastan marcadamente con el fondo y son más fáciles de reconocer bajo el microscopio. Los tintes comúnmente utilizados para tinciones simples incluyen azul de merocianina, violeta cristal y rojo compuesto básico. Cuando la descomposición bacteriana del azúcar produce ácido, de modo que el pH del medio disminuye, la carga positiva de las bacterias aumenta y luego se puede usar en tinciones de rojo, rojo ácido o rojo Congo y otros tintes ácidos. Las bacterias deben fijarse antes de teñir. Su propósito es doble: uno es matar las bacterias y hacer que se adhieran al portaobjetos; el segundo es aumentar su afinidad por el tinte. Normalmente se utilizan dos métodos: calentamiento y fijación química. Intentar mantener la morfología original de las células al fijarlas.
3 materiales
3.1 Cepa Bacillus subtilis 12-18h cultivo inclinado en agar nutritivo, Staphylococcus aureus alrededor de 24 h de cultivo inclinado en agar nutritivo, cultivo inclinado en agar nutritivo de Escherichia coli 24 h, cultivo inclinado en agar de levadura de panadería.
3.2 Tinción Tinción alcalina de azul de metileno de Lue (o tinción de violeta cristal de oxalato de amonio), tinción roja de compuesto de ácido carbólico.
3.3 Instrumentos u otra parafernalia Microscopio, lámpara de alcohol, portaobjetos, anillo de inoculación, portaobjetos, frasco de doble capa (lleno de aceite de cedro y xileno), papel para microscopio, solución salina fisiológica o agua destilada, etc.
4 Procedimiento Frotis → secado → fijación → tinción → lavado → secado → examen microscópico.
5 pasos
5.1 frotis Tomar dos portaobjetos limpios y sin aceite, cada uno con una pequeña gota de solución salina (o agua destilada) en el centro del portaobjetos en condiciones asépticas, con un anillo inoculador para operar asépticamente, respectivamente, del Bacillus subtilis, Garcinia micrococcus y Escherichia coli inclinada para coger un poco de musgo en la gota de agua, mezclando y recubriendo con una película. Si se extiende la suspensión bacteriana (o el cultivo líquido), se puede utilizar el anillo para inocular 2 o 3 anillos directamente sobre el portaobjetos. Tenga en cuenta que la solución salina (agua destilada) y las bacterias no deben ser excesivas y esparcirse uniformemente, no demasiado espesas.
5.2 Secado Secar naturalmente a temperatura ambiente. También se puede secar calentando ligeramente sobre una lámpara de alcohol con el lado recubierto hacia arriba. Sin embargo, no te acerques demasiado a la llama, porque una temperatura demasiado alta destruirá la morfología de las bacterias.
5.3 Fijación Si se utiliza secado por calor, la fijación y el secado se combinan en un solo paso de la misma manera que el secado. Untar, secar y fijar con calor.
5.4 Tinción Coloque el portaobjetos plano sobre el estante para portaobjetos, agregue de 1 a 2 gotas de solución de tinción sobre el frotis (la solución de tinción apenas cubra la película de frotis es apropiado). Tiñe el frotis con Azul Mellanox Básico de Lü durante 1 a 2 minutos y con Rojo Carbonato (o Violeta Cristal de Oxalato de Amonio) durante aproximadamente 1 minuto.
5.5 Enjuague Vierta la solución de tinción y enjuague suavemente con agua del grifo desde un extremo del portaobjetos hasta que el agua que sale del frotis sea incolora. Al enjuagar, no deje que el agua fluya directamente para lavar la superficie recubierta. El flujo de agua no debe ser demasiado rápido ni demasiado grande para evitar que se desprenda la película de barrillo.
5.6 Secado Sacuda las gotas de agua del portaobjetos para que se sequen de forma natural; puede utilizar secador o papel absorbente para absorber el material seco (tenga cuidado de no limpiar el cuerpo bacteriano). 5.7 Examen microscópico El frotis se seca y se examina al microscopio. El frotis debe estar completamente seco antes de poder observarlo con un microscopio de aceite.
6 Resultados Dibuje la morfología de E. coli y Micrococcus garciniae después de una tinción única.
Tinción de Gram
1. Propósito
1.1 Comprender el principio de la tinción de Gram y su importancia en la clasificación e identificación de bacterias.
1.2 Aprender y dominar la técnica de la tinción de Gram y consolidar el aprendizaje del uso de la lente de aceite del microscopio óptico.
