Principio y construcción del microscopio de fluorescencia.
El microscopio de fluorescencia utiliza una fuente de luz puntual de alta eficiencia luminosa, que emite una determinada longitud de onda de luz (como luz ultravioleta de 3650 pulgadas o luz azul violeta de 4200 pulgadas) a través de un sistema de filtrado de color como luz de excitación, y excita las sustancias fluorescentes en la muestra para Emiten varios colores de fluorescencia. Después de eso, se observa mediante la ampliación del objetivo y el ocular. De este modo, incluso con una fluorescencia débil, es fácilmente reconocible y muy sensible en entornos de fuerte contraste, y se utiliza principalmente para estudiar la estructura y función celular, así como la composición química. La estructura básica de un microscopio de fluorescencia se compone de un microscopio óptico común y algunos accesorios (como una fuente de luz fluorescente, un filtro de excitación, un separador de haz bicromático y un filtro de bloqueo, etc.). Fuentes de luz fluorescente: normalmente utilizan lámparas de mercurio de presión ultraalta (50-200W), que pueden emitir luz de varias longitudes de onda. Sin embargo, cada sustancia fluorescente tiene una longitud de onda de luz de excitación que produce la fluorescencia más fuerte, por lo que es necesario agregar filtros de excitación (generalmente filtros de excitación ultravioleta, violeta, azul y verde) para permitir que solo una cierta longitud de onda de luz de excitación pase e ilumine. la muestra, mientras absorbe el resto de la luz. Después de ser irradiada con luz excitada, cada sustancia emite fluorescencia visible con una longitud de onda más larga que la irradiación en un período de tiempo muy corto. La fluorescencia tiene especificidad y generalmente es más débil que la luz de excitación. Para observar una fluorescencia específica, es necesario agregar un filtro de bloqueo (o supresión) detrás de la lente del objetivo. Tiene dos funciones: en primer lugar, absorbe y bloquea la entrada de luz de excitación al ocular para evitar alterar la fluorescencia y dañar los ojos; en segundo lugar, selecciona y permite el paso de una fluorescencia específica, mostrando un color de fluorescencia específico. Ambos tipos de filtros deben seleccionarse para usarse juntos.
Existen dos tipos de microscopios de fluorescencia según su trayectoria óptica:
1. Microscopio de fluorescencia de transmisión: la fuente de luz de excitación se transmite a través del material de la muestra a través de un condensador para excitar la fluorescencia. Se pueden utilizar colectores de luz de campo oscuro de uso común, o colectores de luz ordinarios, para ajustar el reflector para convertir la luz de excitación y la luz lateral sobre la muestra. Este es un microscopio de fluorescencia relativamente anticuado. Su ventaja es que la fluorescencia es fuerte con un aumento bajo, mientras que su desventaja es que la fluorescencia se debilita a medida que aumenta el aumento. Por lo tanto, es mejor para observar materiales de muestra más grandes.
2. Microscopio de fluorescencia de haz descendente Este es un nuevo tipo de microscopio de fluorescencia desarrollado en los tiempos modernos. A diferencia del anterior, la luz de excitación cae desde la lente objetivo hasta la superficie de la muestra, utilizando la misma lente objetivo como condensador de iluminación y lente objetivo para recoger la fluorescencia. Es necesario agregar un separador de haz de doble color al camino óptico, que se encuentra en un ángulo de 45 grados con respecto al uranio ligero. La luz de excitación se refleja en la lente del objetivo y se concentra en la muestra. La fluorescencia generada por la muestra, así como la luz de excitación reflejada desde la superficie de la lente del objetivo y el cubreobjetos, ingresan a la lente del objetivo simultáneamente y regresan al separador de haz dicroico, separando la excitación y la fluorescencia. La excitación residual es entonces absorbida por el filtro de bloqueo. Si se utilizan diferentes combinaciones de filtros de excitación/separadores de haz de color dual/filtro de bloqueo, pueden satisfacer las necesidades de diferentes productos de reacción fluorescentes. La ventaja de este microscopio fluorescente es que el campo de iluminación de visión es uniforme, la imagen es clara y cuanto mayor es el aumento, más fuerte es la fluorescencia.
