Propiedades ópticas de microscopios biológicos
El rendimiento óptico del microscopio está determinado por los siguientes ocho parámetros ópticos básicos (o parámetros):
(1) Apertura numérica
La apertura numérica también se llama relación de espejo. Se refiere al producto del índice de refracción n del medio entre el objeto observado y la lente y el valor del seno de la mitad del ángulo de la lente del objetivo. Usa NA o A. para representar. NA=nsen( /2)
El llamado ángulo de la boca del espejo se refiere al ángulo entre los rayos marginales del punto observado que ingresan a la lente frontal de la lente del objetivo.
La apertura numérica es un parámetro importante de la lente del objetivo y de la lente del condensador, y está estrechamente relacionada con otros parámetros ópticos del microscopio. En general, se espera que cuanto más grande, mejor. Se puede ver en la fórmula que hay dos formas de aumentar la apertura numérica, una es aumentar el ángulo de la boca del espejo y la otra es aumentar el índice de refracción entre la lente del objetivo y la muestra.
Cuando se adopta el primer método, la muestra y el objeto pueden mantenerse lo más cerca posible. Pero no importa qué tan cerca, siempre está a menos de 180 grados. Por lo tanto, sin( /2) también es menor que 1. El índice de refracción del aire es n=1. Por lo tanto, la apertura numérica nsin( /2) del objetivo seco es siempre menor que 1, generalmente entre 0.04 y 0.95.
Cuando se adopta el último método, se puede agregar un medio con un índice de refracción más alto entre la lente del objetivo y la muestra. Por ejemplo, el índice de refracción del aceite de cedro es n=1.515. Cuando se utiliza aceite de cedro como medio, la apertura numérica puede alcanzar más de 1,2. Por eso en algunos casos se utilizan gafas de aceite. En la actualidad, la apertura numérica máxima que puede alcanzar la lente de aceite es de 1,4.
(2) Resolución
La resolución también se denomina tasa de discriminación o poder de resolución. La llamada resolución se refiere a la capacidad del microscopio para distinguir la estructura fina del objeto bajo inspección. Es inversamente proporcional a la distancia de resolución. La distancia de resolución se refiere a la distancia mínima entre dos puntos del objeto que se pueden distinguir. Cuanto menor sea la distancia de resolución, mayor será la resolución del microscopio. Si la distancia entre dos puntos del objeto es menor que la distancia de resolución, los dos puntos se confundirán con un punto y su estructura no se podrá ver con claridad. La resolución del microscopio está determinada por la lente del objetivo. Los oculares solo magnifican y no aumentan la resolución del microscopio.
En el caso de iluminación central normal, la distancia de resolución d de la lente del objetivo se determina mediante la siguiente fórmula.
d=(λ/2)N.A.
En la fórmula: d representa la distancia de resolución, la unidad es el micrón, λ representa la longitud de onda de la luz de iluminación, la unidad también es el micrón.
En luz visible, la longitud de onda con mayor brillo y mayor sensibilidad para el ojo humano es {{0}}.55 μm, y la NA máxima de la lente del objetivo es 1.4. Sustituyendo en la fórmula anterior, d es aproximadamente 0,2 μm. Es decir, con un microscopio óptico ordinario, el límite de la distancia de resolución es 0.2 μm en el caso de iluminación central. Es decir, los microscopios ópticos ordinarios no pueden distinguir entre dos objetos de menos de 0,2 μm.
Usando luz ultravioleta, la longitud de onda de la luz de iluminación se puede reducir, lo que permite que la distancia de resolución alcance 0.1 μm. Pero los rayos ultravioleta no pueden ser vistos por el ojo humano. Solo se puede observar después de tomar una foto.
La longitud de onda del flujo de electrones es solo 0.00387nm. Usando "lentes de electrones" o lentes magnéticos para controlar el flujo de electrones, la distancia de resolución del microscopio electrónico es de hasta unas pocas décimas de nanómetro. Se puede utilizar para observar la estructura de los átomos.
(3) Ampliación
El aumento del microscopio es igual al producto del aumento de la lente del objetivo y el aumento del ocular. En principio, el aumento se puede hacer muy grande. Sin embargo, si los detalles de la muestra no pueden ser resueltos por la lente del objetivo, no importa cuán grande sea el aumento, no tiene sentido. Teóricamente, se puede deducir que el aumento más adecuado del microscopio (llamado aumento efectivo, representado por M efectivamente) está entre 500 y 1000 veces la apertura numérica de la lente del objetivo. Es decir, 500N.A. Menor o igual a M efectivo Menor o igual a 1000N.A.
Dentro del rango de aumento efectivo, los ojos pueden observar durante mucho tiempo sin fatiga. Si el aumento es inferior a 500 NA, será difícil de observar. Si es superior a 1000N.A., deteriorará la calidad de la imagen e incluso provocará una imagen irreal. Por lo tanto, la ampliación sobre 1000N.A. se llama magnificación inválida.
(4) distancia de trabajo
La distancia de trabajo se refiere a la distancia entre la superficie inferior de la lente del objetivo y la superficie superior del cubreobjetos después de enfocar el microscopio, utilizando un cubreobjetos estándar y una longitud de tubo mecánico estándar. Cuanto mayor sea el aumento de la lente del objetivo, menor será la distancia de trabajo. En general, la distancia de trabajo de la lente del objetivo de baja potencia por debajo de 10 veces es 5-7mm, mientras que la distancia de trabajo de la lente de aceite de 100 veces es de solo 0,19 mm.
(5) Profundidad de enfoque
Cuando el microscopio se enfoca en un determinado plano de la muestra, no solo se puede ver claramente el plano del objeto, sino que también se pueden ver claramente al mismo tiempo los planos del objeto superior e inferior conectados a él. La distancia entre los planos del objeto superior e inferior se denomina profundidad de enfoque, o profundidad de enfoque para abreviar.
La profundidad de foco del microscopio es muy pequeña, y cuanto mayor sea la apertura numérica, mayor será el aumento total y menor la profundidad de foco. Por ejemplo, cuando se utiliza una lente de aceite con una NA de 1,25/100 veces y un ocular de 12,5 veces para observar, la profundidad de enfoque es de solo 0,27 μm. Es decir, después de enfocar, solo se puede ver claramente una fina capa de 0,27 μm de espesor a la vez. Los especímenes ordinarios tienen generalmente varias micras de espesor. Para ver el espécimen completo, es necesario utilizar el mecanismo de ajuste fino del microscopio para observar en capas de arriba a abajo.
(6) campo de visión
El campo de visión también se llama campo de visión. Se refiere al alcance del objeto bajo inspección que el microscopio puede ver al mismo tiempo. Por lo general, queremos que el campo de visión sea lo más grande posible. El campo de visión del microscopio está determinado por el campo de visión de la lente del objetivo y el campo de visión del ocular. El campo de visión de la lente de objetivo normal es inferior a 20 mm, y la grande puede alcanzar más de 40 mm. El campo de visión de los oculares ordinarios de 10 aumentos es de 14 mm y los grandes pueden alcanzar más de 24 mm. Una vez diseñados el objetivo y el ocular, se fija su campo de visión. Debido a que el campo de visión de un microscopio general es pequeño, es imposible ver la muestra completa en un campo de visión, solo se puede ver un círculo muy pequeño en la muestra. Además, el tamaño del campo de visión es inversamente proporcional al aumento total del microscopio. Cuanto mayor sea el aumento total, menor será el campo de visión. La solución es utilizar el motor para hacer que cada parte de la muestra entre en el campo de visión por turno y observe por turno.
(7) brillo del espejo
El brillo del espejo se refiere a la claridad y la oscuridad de la imagen del objeto que se ve en el microscopio. Para facilitar la observación, esperamos que la imagen resultante sea más brillante. En el caso de luz exterior constante, el brillo del espejo es proporcional al cuadrado de la apertura numérica e inversamente proporcional al cuadrado del aumento total. Para que la imagen sea más brillante, se debe usar una lente objetivo con una gran apertura numérica con un ocular de bajo aumento. Por ejemplo, en el caso de la misma lente de objetivo, usar un ocular de 5X producirá una imagen especular que es 4 veces más brillante que usar un ocular de 10X.
Para microscopios que utilizan fuentes de luz eléctrica, el brillo de la imagen del espejo se puede controlar ajustando el brillo del iluminador.
(8) Claridad
La claridad de las imágenes del microscopio depende de su sistema óptico, especialmente del rendimiento óptico de la lente del objetivo. Está relacionado con el diseño, fabricación, uso y almacenamiento de microscopios. Es un tema importante y complejo. Desde la perspectiva del uso y el almacenamiento, las principales razones que afectan la claridad son: el grosor del cubreobjetos utilizado no está calificado, el enfoque no está ajustado en la posición ideal, el aumento total es demasiado grande y la lente del aceite la lente no se limpia. Limpiar, lentes con moho, etc.
