Tecnología de imágenes de microscopía multifotónica: microscopía de polarización-resuelta-generación de armónicos y su procesamiento de imágenes
En los microscopios ópticos no lineales, las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se usan comúnmente para observar estructuras fibrosas endógenas, y la intensidad de SHG depende en gran medida del ángulo relativo entre la dirección de polarización del haz incidente y el eje de orientación de la molécula objetivo. Por lo tanto, las imágenes SHG basadas en polarización (P-SHG) pueden obtener información estructural de las moléculas objetivo analizando la relación funcional entre la intensidad de la señal SHG y el estado de polarización del haz incidente. Ahora se utiliza como una herramienta importante para análisis médicos y biológicos.
Se pueden obtener imágenes simples de SHG mediante microscopía de fluorescencia de excitación de dos-fotones (TPM) tradicional. La mayoría de los sistemas TPM todavía utilizan un método de escaneo de haz único basado en un espejo en movimiento, cuya resolución temporal depende de la velocidad del movimiento físico del espejo. Para lograr imágenes más rápidas, el sistema TPM también puede adoptar un método de escaneo multihaz (Figura 1A), uno de los cuales consiste en utilizar una unidad de escaneo de disco giratorio. Esta unidad consta de un plato giratorio con microlentes coaxial y un plato giratorio con orificios, donde las microlentes y los orificios en cada plato corresponden-a-uno.
Cuando el láser pasa a través del plato giratorio de microlentes, el frente de onda cubre múltiples microlentes. Diferentes microlentes enfocan diferentes partes del frente de onda en diferentes posiciones y pasan a través de los orificios correspondientes, formando múltiples microhaces. Estos microrayos que golpean la muestra pueden excitar simultáneamente múltiples señales. Estas señales regresan a lo largo del sistema del microscopio y pasan nuevamente a través del orificio, y finalmente son reflejadas por el espejo dicroico entre los dos platos giratorios hacia el dispositivo de detección. Sin embargo, el láser de zafiro de titanio bloqueado en modo-que se usa comúnmente como fuente de luz tiene energía insuficiente, lo que limita la cantidad de haces de excitación y da como resultado un pequeño campo de visión efectivo (FOV) para TPM (TPM-SD) usando una unidad de escaneo rotativa.
Ai Goto et al. tenía como objetivo lograr imágenes P-SHG de alta-velocidad con un gran campo de visión (FOV) utilizando el sistema TPM-SD. Por lo tanto, se introdujo una fuente láser basada en Yb con mayor potencia máxima en el sistema TPM-SD.
Este es un diagrama esquemático del sistema TPM-SD que desarrollaron. La fuente de luz del sistema es un láser basado en Yb, que genera pulsos de femtosegundos con una longitud de onda central de 1042 nm, una potencia promedio de 4 W, un ancho de pulso de 300 fs y una tasa de repetición de 10 MHz. El sistema primero ajusta la potencia del láser a través de una placa de media onda y un polarizador láser Glan, y luego expande el haz a través de un expansor de haz. El haz expandido se introduce en la unidad de escaneo de la plataforma giratoria y múltiples microhaces que salen de la unidad de escaneo se enfocan en múltiples puntos de la muestra a través de una lente objetivo de inmersión en agua. Para ajustar el estado de polarización del haz de luz en la lente del objetivo, se colocan una placa de media onda y una placa de un cuarto de onda en la trayectoria óptica del haz de excitación.
