Imágenes de microscopía multifotónica: diversas técnicas para obtener imágenes de neuronas in vivo
En comparación con el microscopio de fluorescencia de campo amplio de un solo fotón tradicional, la microscopía multifotónica (MPM) tiene las funciones de corte óptico e imágenes profundas. En 2019, Jerome Lecoq et al. discutió la tecnología MPM relacionada desde tres aspectos: imágenes de neuronas profundas en el cerebro, imágenes de neuronas masivas e imágenes de neuronas de alta velocidad.
Para vincular la actividad de las neuronas con el comportamiento complejo, generalmente es necesario obtener imágenes de las neuronas en la corteza profunda, lo que requiere que MPM tenga la capacidad de generar imágenes profundas. La luz de excitación y emisión será altamente dispersada y absorbida por el tejido biológico, que es el factor principal que limita la profundidad de imagen de MPM. Aunque el problema de dispersión se puede resolver aumentando la intensidad del láser, traerá otros problemas, como quemar la muestra, desenfoque y excitación fluorescente cerca de la superficie. La mejor manera de aumentar la profundidad de las imágenes MPM es utilizar longitudes de onda más largas como luz de excitación.
Además, para las imágenes de dos fotones (2P), la excitación de fluorescencia fuera de foco y cerca de la superficie son los dos factores más importantes que limitan la profundidad, mientras que para las imágenes de tres fotones (3P), estos dos problemas se reducen considerablemente, pero imágenes de tres fotones debido a la fluorescencia La sección transversal de absorción del grupo es mucho más pequeña que la de 2P, por lo que se requiere un orden de magnitud de energía de pulso mayor para obtener la misma intensidad de señal de fluorescencia que la excitada por 2P. La microscopía 3P funcional es más exigente que la microscopía 3P estructural, que requiere un escaneo más rápido para muestrear la actividad neuronal a tiempo; se requiere una energía de pulso más alta para recopilar suficientes señales dentro del tiempo de permanencia de cada píxel.
Los comportamientos complejos a menudo involucran grandes redes cerebrales con conexiones tanto locales como de largo alcance. Para vincular la actividad de las neuronas con el comportamiento, es necesario monitorear la actividad de neuronas muy grandes y ampliamente distribuidas al mismo tiempo. La red neuronal en el cerebro procesa los estímulos entrantes en decenas de milisegundos. Para comprender esta red neuronal rápida Para estudiar la dinámica de las neuronas, se requiere que MPM tenga la capacidad de obtener imágenes de las neuronas rápidamente. Los métodos MPM rápidos se pueden dividir en técnicas de escaneo de un solo haz y técnicas de escaneo de haces múltiples.
La tecnología de escaneo de un solo haz permite atravesar a alta velocidad el tejido neural con un gran campo de visión (FOV)
Cuando se usa MPM para obtener imágenes de las neuronas, el escaneo de acceso aleatorio, es decir, el rayo láser se escanea rápidamente en cualquier punto seleccionado en todo el campo de visión, puede escanear solo las neuronas de interés, lo que no solo evita escanear cualquier fibra nerviosa no etiquetada. también optimizar el tiempo de exploración del rayo láser. El escaneo de acceso aleatorio (Fig. 1) se puede lograr con un deflector acústico-óptico (AOD), que funciona uniendo un transductor piezoeléctrico con una señal de radiofrecuencia a un cristal adecuado. Las ondas acústicas resultantes inducen una rejilla de índice de refracción periódica. La difracción ocurre cuando un rayo láser pasa a través de una rejilla. La intensidad y la frecuencia de la onda de sonido se pueden ajustar mediante la señal eléctrica de radiofrecuencia para cambiar la intensidad y la dirección de la luz difractada, de modo que se pueda realizar un escaneo de puntos arbitrarios horizontales unidimensionales utilizando un AOD, y 3D se puede realizar mediante el uso de un par de AOD combinados con otras tecnologías de exploración axial de exploración de acceso aleatorio. Sin embargo, esta técnica es muy sensible al movimiento de la muestra y propensa a artefactos de movimiento. En la actualidad, el escaneo de trama rápido, es decir, el escaneo progresivo en FOV, se usa ampliamente porque el algoritmo puede resolver fácilmente los artefactos de movimiento.
Imágenes de dos fotones basadas en AOD de neuronas neocorticales L2/3 in vivo[2]
Hay muchas maneras de realizar un escaneo de trama rápido, utilizando un espejo vibratorio para un escaneo 2D rápido, combinando un espejo vibratorio y una lente eléctrica ajustable para un escaneo 3D rápido, pero la lente eléctrica ajustable no puede enfocar rápidamente en la dirección axial debido a la limitación de El cambio de inercia mecánica, que afecta la velocidad de la imagen, ahora se puede reemplazar con un modulador de luz espacial (SLM).
El enfoque remoto también es un medio para lograr imágenes en 3D, como se muestra en la Figura 2. En el módulo LSU, el galvanómetro de escaneo escanea horizontalmente, y el módulo ASU incluye la lente objetivo L1 y el espejo M, y el escaneo axial se realiza ajustando la posición de M. Esta técnica no solo puede corregir la aberración óptica introducida por la lente del objetivo principal L2, sino que también permite un escaneo axial rápido. Para obtener más imágenes de neuronas, el FOV se puede ampliar ajustando el diseño de la lente del objetivo del microscopio, pero la lente del objetivo con NA grande y FOV grande suele ser pesada y no puede moverse rápidamente para un escaneo axial rápido, por lo que los sistemas de FOV grandes dependen de Telefocus , SLM y lentes motorizados ajustables.
Diagrama esquemático de un sistema de imágenes de dos fotones de enfoque remoto [3] La tecnología de escaneo multihaz puede obtener imágenes simultáneamente de diferentes posiciones del tejido neuronal
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 mm aparte) sitios de imágenes (Fig. 3C, D); para las regiones adyacentes, por lo general utiliza múltiples haces de una sola lente de objetivo para obtener imágenes (Fig. 3E, F). La técnica de escaneo de haces múltiples debe prestar especial atención al problema de la diafonía entre los haces de excitación, que puede resolverse mediante el método de separación de fuentes de luz posterior o el método de multiplexación de espacio-tiempo. El método de separación de fuente de luz post-hoc se refiere al uso de algoritmos para separar los haces para eliminar la diafonía; el método de multiplexación espacio-temporal se refiere al uso simultáneo de múltiples haces de excitación, los pulsos de cada haz se retrasan en el tiempo, de modo que los haces individuales excitados por diferentes haces pueden separarse temporalmente. señal fluorescente. Se pueden obtener imágenes de más neuronas introduciendo más haces, pero varios haces aumentarán la superposición del tiempo de decaimiento de la fluorescencia, lo que limita la capacidad de distinguir las fuentes de señal; y la multiplexación tiene un impacto negativo en la velocidad de trabajo de los dispositivos electrónicos. Altos requisitos; una gran cantidad de haces también requiere una mayor potencia de láser para mantener una relación señal-ruido aproximada de un solo haz, lo que puede provocar fácilmente daños en los tejidos.
Tecnología de imágenes de área grande
En los últimos años, el desarrollo de diferentes tecnologías de MPM ha ampliado el alcance de nuestras imágenes del tejido neural, permitiéndonos obtener imágenes de más neuronas en lo profundo del cerebro a una velocidad más rápida, lo que ha promovido en gran medida la investigación en neurociencia y nos ha permitido obtener una comprensión más clara. de la función cerebral.
