Clasificación microscópica y principio de funcionamiento para la investigación celular.
El microscopio es la herramienta principal para observar las células. Según las diferentes fuentes de luz, se puede dividir en dos categorías: microscopios ópticos y microscopios electrónicos. El primero usa luz visible (los microscopios UV usan luz ultravioleta) como fuente de luz, mientras que el segundo usa haces de electrones como fuente de luz.
-,Microscopio optico
(1) microscopio óptico ordinario
Los microscopios biológicos ordinarios se componen de tres partes, a saber: ① sistema de iluminación, que incluye fuente de luz y condensador; ② sistema de aumento óptico, compuesto por lente objetivo y ocular, que es el cuerpo principal del microscopio. Para eliminar la aberración esférica y la aberración cromática, tanto el ocular como el objetivo ③Dispositivo mecánico, utilizado para fijar el material y facilitar la observación (Figura 2-1).
Si la imagen del microscopio es clara no solo se determina por el aumento, sino que también se relaciona con la resolución del microscopio. La resolución se refiere a la capacidad del microscopio (o el ojo humano a 25 cm del objetivo) para distinguir la distancia más pequeña entre los objetos. El tamaño de la resolución está determinado por La longitud de onda y la relación de apertura de la luz y el índice de refracción del medio se expresan mediante la fórmula:
En la fórmula: n=índice de refracción del medio;=ángulo de apertura (el ángulo de apertura de la muestra a la apertura de la lente del objetivo), NA=apertura de la lente (apertura numérica). El ángulo de la lente siempre es inferior a 180 grados, por lo que el valor máximo de sina/2 debe ser inferior a 1.
El índice de refracción del vidrio utilizado para fabricar la lente óptica es de 1,65 a 1,78, y el índice de refracción del medio utilizado está más cerca del vidrio, mejor. Para las lentes de objetivo secas, el medio es el aire y la relación de apertura de la lente es generalmente 0.05 a 0,95; para las lentes de aceite, se usa aceite de cedro como medio, y la relación de apertura de la lente puede estar cerca de 1,5.
La longitud de onda de la luz ordinaria es {{0}}nm, por lo que el valor de resolución del microscopio no será inferior a 0,2 μm, y la resolución del ojo humano es de 0,2 mm, por lo que la el aumento máximo del diseño general del microscopio suele ser de 1000X.
(2) microscopía de fluorescencia
Algunas sustancias en las células, como la clorofila, pueden emitir fluorescencia después de ser irradiadas con rayos ultravioleta; algunas sustancias en sí mismas no pueden emitir fluorescencia, pero si se tiñen con tintes fluorescentes o anticuerpos fluorescentes, también pueden emitir fluorescencia cuando se irradian con rayos ultravioleta, y el microscopio de fluorescencia (Fig. 2-2, 3, 4) es una de las herramientas para la investigación cualitativa y cuantitativa de dichas sustancias.
Los microscopios de fluorescencia y los microscopios ordinarios tienen las siguientes diferencias:
1. El método de iluminación suele ser epi-iluminación, es decir, la fuente de luz se proyecta sobre la muestra a través de la lente del objetivo (Figura 2-3);
2. La fuente de luz es luz ultravioleta, la longitud de onda es más corta y la resolución es más alta que la de los microscopios ordinarios;
3. Hay dos filtros especiales, el que está frente a la fuente de luz se usa para filtrar la luz visible y el que está entre el ocular y la lente del objetivo se usa para filtrar la luz ultravioleta para proteger los ojos.
(3) Microscopio confocal de barrido láser
El microscopio de barrido confocal láser (microscopio de barrido confocal láser, figura 2-5, 6) utiliza el láser como fuente de luz de barrido y escanea imágenes punto por punto, línea por línea, superficie por superficie, y el láser de barrido y la colección de fluorescencia comparten una lente del objetivo, y el foco de la lente del objetivo es El punto focal del láser de escaneo también es el punto del objeto de la imagen instantánea. Debido a que la longitud de onda del rayo láser es corta y el rayo es muy delgado, el microscopio de barrido láser confocal tiene una resolución más alta, que es aproximadamente 3 veces mayor que la de un microscopio óptico común. El sistema se enfoca una vez y la exploración se limita a un plano de la muestra. Cuando la profundidad de enfoque es diferente, se pueden obtener imágenes de diferentes niveles de profundidad de la muestra. Esta información de imagen se almacena en la computadora. A través del análisis y la simulación por computadora, se puede mostrar la estructura tridimensional de la muestra celular.
La microscopía de barrido láser confocal se puede utilizar no solo para observar la morfología celular, sino también para el análisis cuantitativo de los componentes bioquímicos intracelulares, las estadísticas de densidad óptica y la medición de la morfología celular.
(4) microscopio de campo oscuro
El microscopio de campo oscuro (microscopio de campo oscuro, figura 2-7) tiene una hoja de luz en el centro del condensador, de modo que la luz de iluminación no ingresa directamente a la lente humana, y solo la luz reflejada y difractada por la muestra. se permite entrar en la lente del objetivo, por lo que el fondo del campo de visión es negro, los bordes de los objetos son brillantes. Con este microscopio, se pueden ver partículas tan pequeñas como 4-200nm, y la resolución puede ser 50 veces mayor que la de los microscopios comunes.
(5) microscopio de contraste de fase
El microscopio de contraste de fase (microscopio de contraste de fase, Figura 2-8, 9) de P. Zernike fue inventado en 1932 y ganó el Premio Nobel de Física en 1953 por ello. La característica más importante de este microscopio es que puede observar muestras sin teñir y células vivas.
El principio básico de la microscopía de contraste de fase es cambiar la diferencia de trayectoria óptica de la luz visible que pasa a través de la muestra en una diferencia de amplitud, mejorando así el contraste entre varias estructuras y haciendo que varias estructuras sean claramente visibles. Después de atravesar la muestra, la luz se refracta, se desvía del camino óptico original y se retrasa 1/4λ (longitud de onda). Fortalecer, aumentar o disminuir la amplitud, aumentar el contraste. En términos de estructura, los microscopios de contraste de fase tienen dos características especiales que los diferencian de los microscopios ópticos ordinarios:
1. El diafragma anular está ubicado entre la fuente de luz y el condensador, y su función es hacer que la luz que pasa a través del condensador forme un cono de luz hueco y se enfoque en la muestra.
2. La placa de fase (placa de fase anular) agrega una placa de fase recubierta con fluoruro de magnesio en la lente del objetivo, que puede retrasar la fase de luz directa o luz difractada en 1/4λ. Hay dos tipos:
①Placa de fase A plus: La luz directa se retrasa 1/4λ. Después de combinar los dos grupos de ondas de luz, las ondas de luz se suman y la amplitud aumenta. La estructura de la muestra es más brillante que el medio circundante, formando un contraste brillante (o contraste negativo).
② Placa de fase B plus: La luz difractada se retrasa 1/4λ. Después de combinar los dos conjuntos de rayos, las ondas de luz se restan y la amplitud se vuelve más pequeña, formando un contraste oscuro (o contraste positivo), y la estructura es más oscura que el medio circundante.
(6) microscopio polarizador
El microscopio de polarización se utiliza para detectar sustancias con birrefringencia, como filamentos, husos, colágeno, cromosomas, etc. La diferencia con los microscopios comunes es que hay un polarizador (polarizador) frente a la fuente de luz, de modo que la luz que ingresa al microscopio es luz polarizada, y hay un analizador (un polarizador cuya dirección de polarización es perpendicular al polarizador) en el cilindro de la lente. La platina de este microscopio se puede girar. Cuando se coloca una sustancia de refracción simple en la platina, no importa cómo se gire la platina, dado que los dos polarizadores son verticales, no se puede ver luz en el microscopio y la luz no es visible en el microscopio. Al entrar en materiales birrefringentes, la platina giratoria puede detectar tales objetos porque la luz se desvía cuando pasa a través de dichos materiales.
