Aula de imágenes microscópicas 丨 Aplicación de microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM) es una técnica que utiliza la onda evanescente generada por un haz de luz que se propaga entre dos medios de índice de refracción diferentes para sondear la superficie de células vivas marcadas con fluorescencia. En la práctica, cuando un rayo láser incidente encuentra la interfaz entre el cubreobjetos y el medio acuoso que contiene las células, se refleja en el ángulo crítico (reflexión interna total). Debido a que la energía de la onda evanescente disminuye exponencialmente con la distancia desde el cubreobjetos, solo los fluoróforos dentro de los 10 nanómetros de la superficie (entre 10 y 200 nanómetros) son excitados por la onda evanescente, mientras que los fluoróforos más alejados no están excitados. Afectado. Por lo tanto, TIRFM da como resultado altos niveles de señal de fluoróforos ubicados cerca del cubreobjetos, superpuestos sobre un fondo muy oscuro, proporcionando una excelente relación señal-ruido. La limitación extrema de la profundidad de excitación es ideal para estudiar moléculas individuales o composición de membranas y orgánulos en células adherentes cerca de la superficie del cubreobjetos (consulte la Figura 8(e)). Dado que la excitación está restringida a regiones delgadas cerca del cubreobjetos, el fotoblanqueo y la fototoxicidad también están restringidos a estas regiones, lo que convierte a TIRFM en uno de los métodos más útiles para la observación a largo plazo. La técnica se ha convertido en una herramienta fundamental para el estudio de una amplia gama de fenómenos en biología celular y molecular.
La deconvolución es un algoritmo que se aplica a un conjunto de imágenes de enfoque completo adquiridas a lo largo del eje óptico (Z) para mejorar la señal de fotones en una pila de imágenes para un plano de imagen dado o múltiples planos focales. Los microscopios deben estar equipados con unidades de enfoque motorizadas de alta precisión para garantizar la adquisición de imágenes en intervalos definidos con precisión entre los planos focales de la muestra. En una aplicación típica (consulte la Fig. 8(f)), el proceso de deconvolución se utiliza para desenfocar y eliminar la luz desenfocada de un plano focal dado mediante excitación y emisión de fluorescencia de campo amplio. La aplicación más compleja es aplicar el proceso de desconvolución a toda la pila de imágenes para generar vistas proyectadas o modelos 3D. Un conjunto de imágenes de campo amplio utilizadas para la deconvolución captura el número máximo teórico de fotones emitidos por la muestra. El proceso de desconvolución redistribuye las intensidades "borrosas" de los fotones emitidos por encima y por debajo del plano focal de vuelta al plano original. Por lo tanto, la deconvolución utiliza casi todas las intensidades de emisión disponibles y proporciona un presupuesto de luz óptimo, lo que convierte a esta técnica en el método de elección para muestras muy sensibles a la luz.
Una variante del fenómeno de transferencia de energía de resonancia en microscopía de fluorescencia, la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia o Förster (FRET) se utiliza para obtener información temporal y espacial cuantitativa sobre la unión e interacción de proteínas, lípidos, enzimas y ácidos nucleicos en células vivas. FRET puede emplear técnicas de estado constante o resueltas en el tiempo, pero las imágenes FRET resueltas en el tiempo tienen la ventaja de mapear con mayor precisión las distancias donante-aceptor. Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia de campo amplio estándar equipado con filtros de excitación y emisión adecuados y una cámara sensible para obtener imágenes FRET. Los biosensores que intercalan una proteína o un péptido ambientalmente sensible entre dos proteínas fluorescentes aplicables a FRET se utilizan ampliamente en la actualidad en biología celular. Estas sondas se visualizan fácilmente bajo microscopía de fluorescencia de campo amplio utilizando técnicas FRET de emisión sensibilizada combinadas con análisis radiométrico. Además, la obtención de imágenes espectrales y la separación lineal mediante microscopía confocal de barrido láser pueden ayudar a controlar los fenómenos FRET en biosensores y otras aplicaciones de proteínas fluorescentes.
La microscopía de imágenes de la vida útil de la fluorescencia (FLIM) es una técnica sofisticada capaz de registrar simultáneamente la vida útil de la fluorescencia y la ubicación espacial de un fluoróforo en cada ubicación de la imagen. Este método proporciona un mecanismo para estudiar parámetros ambientales como el pH, la concentración iónica, la polaridad del solvente, las interacciones no covalentes, la viscosidad y la tensión de oxígeno en células vivas individuales y presenta los datos en arreglos espaciales y temporales. Las mediciones FLIM de la vida útil del estado excitado en la escala de nanosegundos son independientes de las concentraciones locales de fluoróforos, los efectos del fotoblanqueo y la longitud del camino (grosor de la muestra), pero son sensibles a las reacciones del estado excitado, como la transferencia de energía de resonancia. De hecho, la combinación de FLIM con FRET al monitorear los cambios de por vida de los donantes fluorescentes antes y después de la transferencia de energía de resonancia se considera una de las mejores formas de estudiar este fenómeno.
La movilidad (coeficiente de difusión transversal) de macromoléculas marcadas con fluorescencia y pequeños fluoróforos puede determinarse mediante la técnica de recuperación de fluorescencia después de fotoblanqueo (FRAP). En FRAP, se ilumina intensamente un área seleccionada muy pequeña (unos pocos micrómetros de diámetro), generalmente con un láser, para producir un fotoblanqueo completo del fluoróforo en esa área. El resultado es una drástica reducción o aniquilación de la fluorescencia. Después de un pulso de fotoblanqueo, se controló la tasa y el grado de recuperación de la intensidad de fluorescencia en las regiones blanqueadas en función del tiempo a intensidades de excitación bajas para generar información sobre la cinética de repoblación y recuperación de fluoróforos (Figura 9). FRAP generalmente se realiza utilizando EGFP u otras proteínas fluorescentes. Las técnicas de fotoactivación relacionadas se basan en fluoróforos enjaulados sintéticos especiales o proteínas fluorescentes funcionales similares que pueden activarse mediante pulsos cortos de UV o violeta. La fotoactivación y FRAP se pueden utilizar como técnicas complementarias para determinar los parámetros de movilidad.
En una técnica relacionada con FRAP, llamada pérdida de fluorescencia después del fotoblanqueo (FLIP), una región fluorescente definida dentro de una célula viva sufre un fotoblanqueo repetido por irradiación intensa. Si todos los fluoróforos pudieran difundirse en el área que se está fotoblanqueando durante el período de tiempo medido, esto daría como resultado una pérdida completa de la señal fluorescente en toda la célula. Calculando la velocidad a la que desaparece la fluorescencia de toda la célula, se puede determinar la movilidad de difusión del fluoróforo objetivo. Además, FLIP puede identificar fácilmente la ubicación y la naturaleza de las barreras de difusión entre los compartimentos individuales de las células, como la barrera entre el soma y el axón de una neurona.
La espectroscopia de correlación de fluorescencia (FCS), utilizada principalmente en microscopía confocal de barrido láser o microscopía multifotónica, es un método diseñado para determinar información cinética como velocidades de reacción química, coeficientes de difusión, técnicas de peso molecular, velocidad de flujo y agregación. En FCS, se ilumina un pequeño volumen (aproximadamente un femtómetro; el foco de difracción limitada del láser) con un rayo láser enfocado para registrar las fluctuaciones de intensidad de la autofluorescencia inducidas por la dinámica de las moléculas fluorescentes en función del tiempo en el volumen ocupado por las moléculas fluorescentes. moléculas (Fig. 10). Los fluoróforos relativamente pequeños se difunden rápidamente en el volumen iluminado, produciendo ráfagas cortas de intensidad aleatoria. Por el contrario, los complejos más grandes (fluoróforos unidos a macromoléculas) se mueven más lentamente, produciendo patrones de intensidad de fluorescencia dependientes del tiempo más prolongados y persistentes.
Cuando las estructuras marcadas con fluorescencia están densamente empaquetadas y se superponen en regiones específicas de células vivas, su dinámica y distribución espacial son difíciles de analizar. La microscopía de punto de fluorescencia (FSM) es una técnica compatible con casi todas las modalidades de imagen que aprovecha concentraciones muy bajas de subunidades marcadas con fluorescencia, reduce la fluorescencia fuera de foco y mejora la visibilidad de las estructuras marcadas y su dinámica en regiones gruesas. Los FSM se implementan etiquetando solo una fracción de toda la estructura de interés. En este sentido, FSM es similar a realizar FCS en todo el campo de visión, aunque pone más énfasis en los patrones espaciales que en el análisis temporal cuantitativo. La microscopía de puntos fluorescentes es particularmente útil para determinar la movilidad y la agregación de elementos del citoesqueleto como la actina y los microtúbulos en células hiperactivas.
La microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) es una técnica emergente de súper resolución con una resolución espacial mucho más allá del límite de difracción, que utiliza luz empobrecida en forma de anillo para rodear un haz más pequeño de luz de excitación para obtener sub-50 nm en el eje para la resolución. La técnica se basa en la excitación de fluoróforos con pulsos láser sincronizados y pulsos STED circulares espacialmente coordinados que agotan la luz emitida, suprimiendo la fluorescencia de las moléculas excitadas alrededor del foco de escaneo láser. Se suprime la fluorescencia generada en la periferia de la mancha, pero no en el centro de la mancha, lo que reduce significativamente el tamaño de la mancha fluorescente y, en consecuencia, aumenta significativamente la resolución. STED ha demostrado ser una herramienta útil para la detección de alta resolución de células vivas. Otras técnicas emergentes de superresolución, como la microscopía de localización fotoactivada (PALM) y la microscopía de iluminación de luz estructurada (SIM), también se convertirán en herramientas fundamentales para la obtención de imágenes de células vivas en un futuro próximo.
El uso cada vez mayor de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente y fluoróforos sintéticos avanzados para la obtención de imágenes de células vivas abre la puerta a nuevas modalidades ópticas para monitorear la dinámica temporal y las relaciones espaciales. Los microscopistas ahora tienen un conjunto completo de herramientas para observar y registrar datos de imágenes de procesos celulares que ocurren en una amplia gama de escalas de tiempo y en múltiples resoluciones. Los eventos más lentos se pueden observar y registrar fácilmente mediante microscopía confocal de barrido láser, mientras que los eventos cinéticos más rápidos se pueden obtener mediante la tecnología de disco giratorio. Además, la microscopía multifotónica permite obtener imágenes profundas en tejidos gruesos, y las técnicas de reflexión interna total permiten sondear superficies de membrana con precisión confocal. Los métodos de fluorescencia avanzados, como FRET, FLIM, FRAP, FCS, FSM, SIM, PALM y STED, se pueden usar para monitorear las interacciones proteína-proteína a resoluciones a menudo mejores que las permitidas por el límite de difracción. Con los avances en la tecnología de fluoróforos, microscopios y detectores, un mundo más amplio será puesto "bajo el microscopio".
