Conocimientos relacionados con la microscopía de fluorescencia confocal.
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal es utilizar una fuente de luz puntual para irradiar la muestra, formando un pequeño punto bien definido en el plano focal. La fluorescencia emitida por la mancha después de la irradiación es recogida por la lente del objetivo y enviada de regreso al espectrofotómetro compuesto por un espejo de color bidireccional a lo largo de la trayectoria de irradiación original. El espectrofotómetro envía fluorescencia directamente al detector. Hay dos orificios delante de la fuente de luz y el detector, denominados respectivamente orificios de iluminación y orificios de detección. Las dimensiones geométricas de los dos son consistentes, aproximadamente 100-200nm; En comparación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, lo que significa que el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y, en última instancia, puede enfocar tanto en el orificio de iluminación como en el orificio de detección simultáneamente. De esta manera, la luz del plano focal puede converger dentro del alcance del orificio de detección, mientras que la luz dispersada desde arriba o por debajo del plano focal queda bloqueada fuera del orificio de detección y no puede ser fotografiada. Al escanear la muestra punto por punto con un láser, el tubo fotomultiplicador, después de detectar el orificio, también obtiene la imagen confocal correspondiente de la luz punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora. Finalmente, se sintetiza en la pantalla una imagen confocal clara de todo el plano focal.
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra, que siempre tiene un cierto espesor, también conocida como sección óptica delgada. Debido al hecho de que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que la del punto no focal, y la luz del plano no focal se filtra mediante orificios, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero. El escaneo a lo largo de la dirección del eje Z puede lograr una tomografía óptica, formando un corte óptico bidimensional en el punto focal de la muestra observada. Al combinar el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), se puede obtener una imagen tridimensional de la muestra acumulando capas continuas de imágenes bidimensionales y procesándolas con software informático especializado.
El orificio de detección y el orificio de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano de enfoque no puede entrar en el orificio de detección.
La expresión simple del principio de funcionamiento de la microscopía confocal láser es que utiliza un láser como fuente de luz y agrega un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado sobre la base de las imágenes de microscopía de fluorescencia tradicional. Es un sistema controlado por una computadora para la adquisición y procesamiento de imágenes digitales.
