Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia de dos-fotones
El principio básico de la excitación de dos-fotones es que, a una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber simultáneamente dos fotones de longitud de onda larga y emitir un fotón de longitud de onda más corta después de un corto período de vida del llamado-estado excitado; El efecto es el mismo que utilizar un fotón con la mitad de la longitud de onda larga para excitar moléculas fluorescentes. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones y, para evitar dañar las células, la microscopía de dos-fotones utiliza láseres de pulso bloqueado en modo de alta-energía-. El láser emitido por este láser tiene una energía máxima alta y una energía promedio baja, con un ancho de pulso de solo 100 femtosegundos y una frecuencia de hasta 80 a 100 megahercios. Cuando se utiliza una lente objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones de un láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente objetivo es la más alta y la excitación de dos-fotones solo ocurre en el punto focal de la lente objetivo. Por lo tanto, el microscopio de dos-fotones no requiere un orificio confocal, lo que mejora la eficiencia de la detección de fluorescencia.
En los fenómenos de fluorescencia generales, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón a la vez y luego emitir otro fotón fluorescente a través de una transición radiativa, lo que se conoce como fluorescencia de fotón único. Para los procesos de excitación de fluorescencia que utilizan láseres como fuentes de luz, pueden ocurrir fenómenos de fluorescencia de dos-fotones o incluso multifotónicos. En este caso, la fuente de luz de excitación utilizada tiene alta intensidad y densidad de fotones que cumple con el requisito de que las moléculas fluorescentes absorban dos fotones simultáneamente. En el proceso de utilizar un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún es insuficiente para producir un fenómeno de absorción de dos-fotones. Normalmente se utilizan láseres de pulso de femtosegundo, cuya potencia instantánea alcanza el nivel de megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos-fotones es más corta que la de la luz de excitación, equivalente al efecto producido por la excitación de longitud de onda de media excitación.
