Introducción a la Microscopía de Fluorescencia
La microscopía de fluorescencia consiste en irradiar el objeto teñido con fluoresceína con luz de longitud de onda corta, de modo que se excite para producir fluorescencia de longitud de onda larga y luego se observe. En un microscopio de fluorescencia, la luz de excitación de una longitud de onda específica debe seleccionarse de la luz de iluminación de la muestra para generar fluorescencia, y luego la fluorescencia debe separarse de la luz mixta de la luz de excitación y la fluorescencia para su observación. Por lo tanto, el sistema de filtro juega un papel extremadamente importante en la selección de una longitud de onda específica. Los microscopios de fluorescencia se utilizan ampliamente en biología, medicina y otros campos.
1. Los componentes principales del microscopio de fluorescencia:
(A) Fuente de luz: La fuente de luz irradia luz de varias longitudes de onda (desde ultravioleta hasta infrarrojo). el
(B) Fuente de luz del filtro de excitación: a través de la luz de una longitud de onda específica que puede hacer que la muestra produzca fluorescencia, mientras bloquea la luz que es inútil para excitar la fluorescencia. el
(C) Muestras fluorescentes: generalmente teñidas con pigmentos fluorescentes. el
(D) Filtro de bloqueo: bloquea la luz de excitación que no es absorbida por la muestra y transmite selectivamente la fluorescencia, y algunas longitudes de onda se transmiten selectivamente en la fluorescencia.
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2. Clasificación de los microscopios de fluorescencia:
Los microscopios de fluorescencia generalmente se dividen en dos tipos: transmisión y epi-emisión:
a. Tipo de transmisión: la luz de excitación proviene de la parte inferior del objeto a inspeccionar, y el condensador es un condensador de campo oscuro, de modo que la luz de excitación no ingresa a la lente del objetivo, pero la fluorescencia ingresa a la lente del objetivo. Es brillante a bajos aumentos, pero oscuro a grandes aumentos. Es difícil de operar en inmersión en aceite y centrado. Es especialmente difícil determinar el rango de iluminación con aumentos bajos, pero puede obtener un fondo de campo de visión muy oscuro. El tipo de transmisión no se utiliza para objetos no transparentes. el
b. Epi-tipo: El tipo de transmisión está casi eliminado en la actualidad. La mayoría de los nuevos microscopios de fluorescencia son de tipo epi. La fuente de luz proviene de arriba del objeto a inspeccionar, y hay un divisor de haz en el camino óptico, por lo que es adecuado para inspeccionar objetos transparentes y opacos. Dado que la lente del objetivo actúa como una lente condensadora, no solo es fácil de operar, sino que también puede lograr una iluminación uniforme de todo el campo de visión, desde un aumento bajo hasta un aumento alto. el
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3. Precauciones para la fluoroscopia
a. La irradiación a largo plazo de la luz de excitación provocará la atenuación y extinción de la fluorescencia, por lo tanto, acorte el tiempo de observación tanto como sea posible y use un deflector para cubrir la luz de excitación cuando no esté observando temporalmente. el
b. Cuando observe con una lente de inmersión en aceite, utilice "aceite no fluorescente". el
C. La fluorescencia es casi siempre débil y debe llevarse a cabo en una habitación oscura. el
d. Lo mejor es instalar un estabilizador de voltaje en la fuente de alimentación; de lo contrario, el voltaje inestable no solo reducirá la vida útil de la lámpara de mercurio, sino que también afectará el efecto de la inspección del microscopio. el
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4. Uso de Microscopía de Fluorescencia
1. Requisitos de preparación para muestras de microscopio de fluorescencia
a. Portaobjetos de vidrio
El grosor del portaobjetos de vidrio debe estar entre 0,8 y 1,2 mm. Un portaobjetos demasiado grueso absorberá más luz por un lado y, por otro lado, la luz de excitación no se podrá concentrar en la muestra. Los portaobjetos deben ser lisos, de grosor uniforme y libres de autofluorescencia obvia. A veces se utilizan portaobjetos de vidrio de cuarzo. el
b. Vidrio de protección
El grosor de la cubierta de vidrio es de aproximadamente 0.17 mm, liso. Para fortalecer la luz de excitación, también se puede usar un cubreobjetos seco, que es un cubreobjetos especial recubierto con varias capas de sustancias (como el fluoruro de magnesio) que tienen diferentes efectos de interferencia en la luz de diferentes longitudes de onda, lo que puede hacer que la la fluorescencia va sin problemas. La luz de excitación pasa y la luz de excitación reflejada excita la muestra. el
C. Muestra
Las rebanadas de tejido u otras muestras no deben ser demasiado gruesas. Si es demasiado gruesa, la mayor parte de la luz de excitación se consumirá en la parte inferior de la muestra, mientras que la parte superior observada directamente por la lente del objetivo no podrá excitarse por completo. Además, la superposición celular o las impurezas se encubren, lo que afecta el juicio. el
d. agente de montaje
La glicerina se usa comúnmente como agente de montaje, que no debe tener autofluorescencia, incolora y transparente, y el brillo de la fluorescencia es más brillante a pH 8.5-9.5, y no es fácil que se desvanezca rápidamente. Por lo tanto, una mezcla a partes iguales de glicerol y 0.5mol/L de solución tampón de carbonato con un pH de 9.0 a 9.5 se usa comúnmente como agente de montaje. el
mi. aceite de espejo
Por lo general, se debe usar aceite de inmersión cuando se observan muestras con microscopios de fluorescencia de campo oscuro y objetivos de inmersión de inmersión en aceite. Lo mejor es usar un aceite de espejo especial no fluorescente, que también se puede reemplazar por la glicerina mencionada anteriormente, y también se puede usar parafina líquida, pero el índice de refracción es bajo, lo que afecta ligeramente la calidad de la imagen.
