Cómo elegir el microscopio de fluorescencia adecuado
El microscopio de fluorescencia es un equipo de imágenes microscópicas estándar en laboratorios y departamentos de patología, que utiliza características de fluorescencia para observación e imágenes. Es ampliamente utilizado en diversos campos como biología celular, neurobiología, botánica, microbiología, patología, genética, etc. Las imágenes de fluorescencia tienen las ventajas de una alta sensibilidad y especificidad, lo que las hace muy adecuadas para observar la distribución de proteínas, orgánulos, etc. . en tejidos y células, estudiando colocalización e interacciones, rastreando procesos dinámicos de la vida, como cambios en la concentración de iones, etc.
Selección de microscopios.
Los microscopios de fluorescencia se dividen principalmente en tres categorías: microscopios de fluorescencia verticales (adecuados para cortar), microscopios de fluorescencia invertida (adecuados para células vivas y también para cortar) y microscopios de fluorescencia estéreo (adecuados para especímenes más grandes, como plantas, peces cebra (adultos/ embrionario), medaka, órganos de ratón/rata, etc.).
Selección de bloques de filtros fluorescentes.
La selección de bloques de filtros no solo debe considerar las longitudes de onda de excitación y emisión de las sondas fluorescentes, sino también si existe excitación no específica y si existe interferencia de color para muestras marcadas con varios colores. En el experimento, elegiremos la longitud de onda más cercana al pico de excitación tanto como sea posible para la excitación, y el rango de recepción debe incluir la emisión máxima. El pico de excitación de Alexa Fluor 488 es de 500 nm y se puede seleccionar un filtro de excitación 480/40 en un microscopio de fluorescencia. Los bloques de filtros fluorescentes comúnmente utilizados en microscopía de fluorescencia se pueden dividir en dos tipos: paso largo (LP) y paso de banda (BP), que también deben seleccionarse según las necesidades.
microscopio confocal
En las observaciones tradicionales con microscopía de fluorescencia, debido a la superposición de sustancias marcadas con fluorescencia y estructuras de fluorescencia espontáneas, están estrechamente unidas. Sin embargo, los objetivos tradicionales de microscopía de fluorescencia descendente no sólo recogen la luz del plano focal, sino que también la dispersan hacia arriba y hacia abajo del plano focal, lo que da como resultado una reducción significativa en la resolución y el contraste de la imagen.
Las imágenes confocales solo detectan la luz reflejada desde el plano de autoenfoque, resolviendo así el problema anterior. La fuente de luz forma un punto pequeño y fino en el plano focal a través de un orificio, y la luz emitida desde el plano focal se recoge a través de la lente del objetivo. La mayor parte de la fluorescencia emitida desde puntos por encima o por debajo del plano focal de la lente del objetivo no puede converger hacia el orificio. Sólo la fluorescencia ubicada en el plano focal y una pequeña porción de la fluorescencia desenfocada pueden pasar a través del orificio, mientras que el haz de luz fuera del plano focal converge delante o detrás de la placa del orificio y no puede ingresar al detector a través del orificio. La imagen detectada es del plano focal, por lo que la calidad de la imagen final mejora considerablemente.
Debido a las diversas ventajas y practicidad de la microscopía confocal de barrido láser, actualmente es un asistente experimental indispensable en los campos de la biología celular, la botánica y la investigación celular de alta precisión. Al mismo tiempo, en los futuros centros de investigación científica, será la herramienta de investigación más básica y central.
