¿Cuánto sabes sobre microscopía de fluorescencia?
Los microscopios de fluorescencia generalmente usan lámparas de mercurio de alta intensidad como fuentes de luz de excitación. Los filtros se utilizan para filtrar la luz no deseada, dejando solo la luz pura de alta intensidad que excita el fluoróforo. Después de que la luz monocromática irradie la muestra a través de la lente del objetivo, la muestra se excitará para emitir luz (fluorescencia), y tanto la fluorescencia como la luz de excitación regresarán a lo largo del camino óptico de la lente del objetivo. En este caso, se requiere un espejo dicroico para filtrar la luz de excitación. , dejando solo la fluorescencia que necesitamos para ver a través.
Esta fluorescencia llega al ocular a lo largo del camino de luz del microscopio y luego entra en nuestros ojos, donde podemos ver la fluorescencia emitida por el fluoróforo.
Comprobación previa y ajuste del microscopio de fluorescencia:
(1) Antes de cada observación de fluorescencia, es necesario comprobar de forma rutinaria la alineación del filamento, el enfoque de la trayectoria óptica, el diafragma de apertura y los ajustes del diafragma de campo del dispositivo de fluorescencia.
(2) Si se instaló el conjunto de filtro de excitación/emisión de fluorescencia requerido en el convertidor, si la lente del objetivo del microscopio de fluorescencia está configurada correctamente y elimine las manchas de aceite y el polvo de la lente frontal de la lente del objetivo.
(3) Si la observación del contraste de fase de la luz transmitida se lleva a cabo al mismo tiempo, es necesario verificar la conjugación del centro del condensador y el anillo de contraste de fase opuesto a la lente del objetivo.
(4) Compruebe si el portamuestras (portaobjetos, cubreobjetos y otros utensilios) está cubierto de líquido o polvo, y si el grosor se encuentra dentro del rango de distancia de trabajo calibrado de la lente del objetivo. La muestra en rodajas no debe ser demasiado gruesa, preferiblemente menor o igual a 10 μm.
(5) Debido a que la fuente de iluminación contiene rayos ultravioleta, se coloca una placa de protección contra la luz marrón sobre el frente del escenario para evitar que los rayos ultravioleta dañen la retina.
(6) La inestabilidad del voltaje reducirá la vida útil de la lámpara de mercurio de alta presión, y la fuente de alimentación de la fuente de luz está equipada con un estabilizador de voltaje.
(7) Para prolongar la vida útil de la lámpara de mercurio, se puede apagar 15 minutos después de encenderla; Una vez que se apaga la potencia fluorescente de la lámpara de mercurio, debe esperar al menos 10 minutos para reiniciar el vapor de mercurio para que se enfríe y vuelva a su estado original; de lo contrario, la vida útil de la lámpara se verá afectada.
Observación de imágenes por microscopio de fluorescencia:
(1) Aproximadamente 5-10 minutos después de encender la fuente de luz fluorescente, la intensidad de la luz de excitación tiende a ser estable y la muestra se carga para su observación; Para evitar la extinción de la fluorescencia de la muestra causada por una luz de excitación excesiva durante el proceso de enfoque y búsqueda de objetos, primero aleje el microscopio de fluorescencia Ajuste la luz de excitación a una intensidad moderada con un diafragma de apertura o agregue un filtro ND, y mueva la platina de muestra con regularidad. Después de confirmar la imagen del espejo, ajuste el estado fluorescente para disparar y grabar.
(2) Ajustes por mala calidad de imagen. Además de los factores de preparación de la muestra, los ajustes necesarios que se pueden hacer son:
① Excluir dispositivos de protección de luz o limitadores de luz en la ruta óptica de imágenes, como accesorios DIC, filtros ND, etc.
②Reajuste el enfoque del receptor y el tamaño del diafragma de apertura del microscopio de fluorescencia.
③ Ajuste con cuidado el anillo de corrección de la diferencia de cobertura de la lente del objetivo del microscopio de fluorescencia.
Puntos de aplicación de la microscopía de fluorescencia
La microscopía de fluorescencia utiliza imágenes de "fluorescencia actínica". Si la longitud de onda de excitación seleccionada está en la región ultravioleta cercana (320-400nm), que es invisible a simple vista, el espectro de emisión de fluorescencia también es más corto que la longitud de onda promedio de las fuentes de luz de espejo de luz ordinarias. mejorar. Los fotones de alta energía chocan con los electrones, lo que hace que los electrones pasen del estado fundamental al estado excitado. Los electrones en el estado excitado son muy inestables y volverán al estado fundamental. En este proceso se consumirá parte de la energía térmica y se emitirán nuevos fotones. El nuevo fotón tiene una energía más baja que el fotón original y, por lo tanto, tiene una longitud de onda más larga. Dado que la longitud de onda del nuevo fotón es diferente de la longitud de onda del fotón de la luz incidente, los dos haces de luz con diferentes longitudes de onda se separan mediante un determinado método de procesamiento óptico, de modo que solo vemos los nuevos fotones emitidos (señal de fluorescencia), es decir, el microscopio de fluorescencia ve imágenes de fluorescencia.
