La microscopía de fluorescencia se diferencia de la microscopía convencional.
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz para irradiar el objeto a inspeccionar, de modo que el objeto emita luz y luego observe el objeto bajo el microscopio. Se utiliza principalmente para células de inmunofluorescencia. Se compone principalmente de una fuente de luz, un sistema de placa de filtro y un sistema óptico para observar la imagen fluorescente de la muestra a través del aumento del ocular y la lente del objetivo. Echemos un vistazo a la diferencia entre este microscopio de fluorescencia y un microscopio óptico común.
1. Mira el método de iluminación.
El método de iluminación del microscopio de fluorescencia es generalmente episcópico, es decir, la fuente de luz se proyecta sobre la muestra de prueba a través de la lente objetivo.
2. Mira la resolución
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz y la longitud de onda es relativamente corta, pero la resolución es mayor que la de los microscopios ópticos comunes.
3. La diferencia en el filtro.
Los microscopios de fluorescencia utilizan dos filtros especiales, que se utilizan delante de la fuente de luz para filtrar la luz visible y entre la lente del objetivo y el ocular para filtrar los rayos ultravioleta, que pueden proteger los ojos humanos.
El microscopio de fluorescencia también es un tipo de microscopio óptico, principalmente porque la longitud de onda excitada por el microscopio de fluorescencia es corta, por lo que esto lleva a la diferencia en estructura y uso entre el microscopio de fluorescencia y el microscopio ordinario. La mayoría de los microscopios de fluorescencia tienen la buena función de capturar luz débil, por lo que bajo fluorescencia extremadamente débil, su capacidad de obtención de imágenes también es buena. Junto con la mejora continua de los microscopios de fluorescencia en los últimos años, el ruido también se ha reducido considerablemente. Por eso se utilizan cada vez más microscopios de fluorescencia.
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Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia de fotones.
El principio básico de la excitación de dos fotones es: en el caso de una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo y emitir un fotón de longitud de onda más corta después de un breve período de vida llamado estado excitado; el efecto es el mismo que utilizar un fotón con una longitud de onda la mitad de la longitud de onda larga para excitar moléculas fluorescentes. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones. Para no dañar las células, la microscopía de dos fotones utiliza láseres pulsados de modo bloqueado de alta energía. El láser emitido por este láser tiene una energía máxima alta y una energía promedio baja, su ancho de pulso es de solo 100 femtosegundos y su frecuencia puede alcanzar de 80 a 100 megahercios. Cuando se utiliza una lente objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente objetivo es la más alta y la excitación de dos fotones solo ocurre en el punto focal de la lente objetivo, por lo que la El microscopio de dos fotones no requiere un orificio confocal, lo que mejora la eficiencia de detección de fluorescencia.
En los fenómenos de fluorescencia generales, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón fluorescente a través de una transición radiativa, que es fluorescencia de fotón único. Para el proceso de excitación de la fluorescencia que utiliza láser como fuente de luz, puede producirse una fluorescencia de dos fotones o incluso de múltiples fotones. En este momento, la intensidad de la fuente de luz de excitación utilizada es alta y la densidad de fotones cumple con los requisitos de las moléculas fluorescentes que absorben dos fotones al mismo tiempo. En el proceso de utilizar un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para producir el fenómeno de absorción de dos fotones. Por lo general, se utiliza un láser pulsado de femtosegundo y su potencia instantánea puede alcanzar el orden de megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la longitud de onda de la luz de excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación a la mitad de la longitud de onda de excitación.
La microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene muchas ventajas:
1) La luz de longitud de onda larga se ve menos afectada por la dispersión que la luz de longitud de onda corta y penetra fácilmente en la muestra;
2) Las moléculas fluorescentes fuera del plano focal no se excitan, de modo que pueda llegar más luz de excitación al plano focal, de modo que la luz de excitación pueda penetrar muestras más profundas;
3) La luz del infrarrojo cercano de longitud de onda larga es menos tóxica para las células que la luz de longitud de onda corta;
4) Cuando se utiliza un microscopio de dos fotones para observar muestras, el fotoblanqueo y la fototoxicidad se producen sólo en el plano focal. Por lo tanto, la microscopía de dos fotones es más adecuada que la microscopía de fotón único para observar muestras gruesas, células vivas o experimentos de fotoblanqueo puntual.
Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia confocal.
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal: la muestra se irradia con una fuente de luz puntual y se forma un pequeño punto de luz bien definido en el plano focal. Después de irradiar el punto, la fluorescencia emitida es recogida por la lente del objetivo y enviada de regreso al divisor de haz compuesto por un espejo dicroico a lo largo de la trayectoria de iluminación original. El divisor de haz envía la fluorescencia directamente al detector. Delante de la fuente de luz y del detector hay un orificio, llamado respectivamente orificio de iluminación y orificio de detección. El tamaño geométrico de los dos es el mismo, aproximadamente 100-200 nm; En relación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y finalmente se puede enfocar en el orificio de iluminación y el orificio de detección al mismo tiempo. De esta manera, la luz del plano focal puede converger dentro del alcance del orificio de detección, mientras que la luz dispersada desde arriba o debajo del plano focal queda bloqueada fuera del orificio de detección y no puede ser fotografiada. El láser escanea la muestra punto por punto, y el tubo fotomultiplicador después de detectar el orificio también obtiene la imagen confocal de la luz correspondiente punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora, y finalmente se agrega en una imagen clara. Imagen confocal de todo el plano focal en la pantalla.
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra, y esta sección transversal óptica siempre tiene un cierto espesor, también conocida como sección óptica delgada. Dado que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que la del punto no focal, y la luz del plano no focal es filtrada por el orificio, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero y el escaneo a lo largo del El eje Z puede realizar tomografía óptica, formando un corte óptico bidimensional en el punto enfocado de la muestra a observar. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), la imagen tridimensional de la muestra se puede obtener acumulando imágenes bidimensionales de capas continuas y procesándolas mediante un software informático especial.
Es decir, el orificio de detección y el orificio de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano focal no puede entrar en el orificio de detección.
La expresión simple del principio de funcionamiento del láser confocal es que utiliza luz láser como fuente de luz. Sobre la base de las imágenes de microscopio de fluorescencia tradicionales, agrega un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado, y es un sistema para la adquisición y el procesamiento de imágenes digitales mediante control por computadora.
