Los microscopios de fluorescencia se pueden dividir en dos tipos de acuerdo con el principio de ruta óptica:
1. Microscopio de fluorescencia de transmisión
Los microscopios de fluorescencia más antiguos usan un foco para excitar la fluorescencia al pasar la fuente de luz de excitación a través del material de la muestra. Su ventaja es una fuerte fluorescencia a baja aumento, pero su desventaja es que su fluorescencia disminuye al aumentar el aumento. Por lo tanto, solo es adecuado para observar materiales de muestra más grandes.
2. Microscopio de fluorescencia de luz que cae
La luz de excitación cae de la lente objetivo en la superficie de la muestra, utilizando la misma lente objetivo que el condensador de iluminación y la lente objetivo para recolectar fluorescencia.
Se debe agregar un divisor de haz de doble color (espejo dicroico) a la ruta óptica, que forma un ángulo de 45 grados con el eje óptico. La luz de excitación se refleja en la lente objetivo y se centra en la muestra. La fluorescencia generada por la muestra, así como la luz de excitación reflejada desde la superficie de la lente objetivo y el vidrio de cubierta, ingrese la lente objetivo al mismo tiempo y regrese al divisor de haz de color dual para separar la luz de excitación y la fluorescencia. La luz de excitación residual se bloquea mediante la absorción del filtro. Si se utilizan diferentes combinaciones de filtros de excitación, separadores de haz de doble color y filtros de bloqueo, pueden satisfacer las necesidades de diferentes productos de reacción fluorescentes.
Las ventajas de este microscopio de fluorescencia son la iluminación de campo uniforme, imágenes claras y fluorescencia más fuerte con mayor aumento.
3. Microscopio de contraste de fase
El microscopio de contraste de fase es un microscopio que puede convertir la diferencia de fase (u diferencia de ruta óptica) generada cuando la luz pasa a través de un objeto a la amplitud (intensidad de la luz) cambia. Se utiliza principalmente para observar células vivas, secciones de tejido no tintas o muestras teñidas que carecen de contraste.
El ojo humano solo puede distinguir los cambios en la longitud de onda (color) y la amplitud de la luz visible, pero no puede distinguir los cambios en la fase. La mayoría de las muestras biológicas son altamente transparentes, y la amplitud de las ondas de luz permanece básicamente sin cambios después de pasar, con solo cambios de fase.
El microscopio de contraste de fase básicamente convierte la diferencia de ruta óptica de la luz visible que pasa a través del espécimen en la diferencia de amplitud, mejorando así el contraste entre varias estructuras y haciéndolas claras y visibles. Después de pasar por el espécimen, la luz sufre refracción, se desvía de la ruta óptica original y se retrasa 1/4 λ (longitud de onda). Si la diferencia de ruta óptica aumenta o disminuye en otro 1/4 λ, la diferencia de ruta óptica se convierte en 1/2 λ, y la interferencia entre las dos vigas de luz aumenta o disminuye después de que se combina el eje, mejorando el contraste.
