Conocimientos relacionados con el microscopio de fluorescencia.
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal: se utiliza una fuente de luz puntual para irradiar la muestra y se forma un pequeño punto de luz bien definido en el plano focal. compuesto por divisores. El divisor de haz envía la fluorescencia directamente al detector. Hay un agujero de alfiler delante de la fuente de luz y el detector, llamados respectivamente el agujero de alfiler de iluminación y el agujero de alfiler de detección. El tamaño geométrico de los dos es el mismo, alrededor de 100-200nm; en relación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y finalmente se puede enfocar en el orificio de iluminación y el orificio de detección al mismo tiempo. De esta forma, la luz del plano focal puede converger dentro del alcance del orificio de detección, mientras que la luz dispersada por encima o por debajo del plano focal queda bloqueada fuera del orificio de detección y no se puede visualizar. El láser escanea la muestra punto por punto, y el tubo fotomultiplicador después de detectar el agujero de alfiler también obtiene la imagen confocal de la luz correspondiente punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora, y finalmente se agrega en un claro imagen confocal de todo el plano focal en la pantalla.
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra, y esta sección transversal óptica siempre tiene un cierto grosor, también conocido como sección delgada óptica. Dado que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que en el punto no focal, y la luz del plano no focal se filtra por el agujero de alfiler, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero y el escaneo a lo largo de la Z -eje puede realizar tomografía óptica, formando una Observe la sección óptica bidimensional en el punto enfocado de la muestra. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), la imagen tridimensional de la muestra se puede obtener acumulando imágenes bidimensionales de capas continuas y procesadas por un software de computadora especial.
Es decir, el agujero de alfiler de detección y el agujero de alfiler de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano focal no puede entrar en el agujero de alfiler de detección.
La simple expresión del principio de funcionamiento del láser confocal es que utiliza luz láser como fuente de luz. Sobre la base de imágenes de microscopio de fluorescencia tradicional, agrega un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado, y es un sistema para la adquisición y procesamiento de imágenes digitales a través del control de la computadora.
