Conteo directo con un microscopio para microbios
Principio experimental
El conteo directo bajo un microscopio usando un hemocitómetro es un método de conteo microbiano de uso común. La ventaja de este método es que es intuitivo y rápido. Coloque la suspensión bacteriana diluida adecuadamente (o la suspensión de esporas) en la cámara de recuento entre el portaobjetos y el cubreobjetos del hemocitómetro y cuente bajo el microscopio. Dado que el volumen de la cámara de recuento es fijo (0,1 mm2), se puede convertir en el número total de microorganismos por unidad de volumen según el número de microorganismos observados bajo el microscopio. Debido a que este método cuenta la suma de bacterias vivas y muertas, también se le llama método de conteo total de bacterias.
Un hemocitómetro suele ser un portaobjetos de vidrio especial en el que cuatro ranuras forman tres plataformas. La plataforma en el medio está dividida en dos mitades por una ranura horizontal corta. Una cuadrícula está grabada en la plataforma a cada lado. Cada cuadrícula está dividida en nueve cuadrados grandes. El cuadrado grande en el medio es la sala de conteo. Los microorganismos se cuentan en la cámara de recuento. La estructura de la tabla de recuento de glóbulos se muestra en la Figura Ⅷ-1.
La escala de la sala de conteo generalmente tiene dos especificaciones, una es que un cuadrado grande se divide en 16 cuadrados medios, y cada cuadrado medio se divide en 25 cuadrados pequeños (Figura Ⅷ-2); el otro es un cuadrado grande. El cuadrado está dividido en 25 cuadrados medios, y cada cuadrado medio está dividido en 16 cuadrados pequeños (Figura Ⅷ-1, C). Pero no importa qué tipo de tablero sea, el número de cuadrados pequeños en cada cuadrado grande es el mismo, es decir, 16 × 25=400 cuadrados pequeños, como se muestra en la Figura Ⅷ-2.
La longitud del lado de cada cuadrado grande es de 1 mm y el área de cada cuadrado grande es de 1 mm2. Después de cubrir el cubreobjetos, la altura entre el portaobjetos y el cubreobjetos es 0,1 mm, por lo que el volumen de la cámara de recuento es 0,1 mm3.
Al contar, generalmente cuente el número total de bacterias en los cinco cuadrados centrales, luego obtenga el valor promedio de cada cuadrado central y luego multiplique por 16 o 25 para obtener el número total de bacterias en un cuadrado grande, y luego Conviértalo al número total de bacterias en 1 ml de solución bacteriana.
Equipo de laboratorio
hemocitómetro, microscopio, cubreobjetos, capilar estéril;
Materiales Experimentales
Suspensión de Saccharomyces cerevisiae
Procedimiento experimental (método de recuento directo con microscopio microbiano)
1. dilución
Diluya adecuadamente la suspensión de Saccharomyces cerevisiae. Si la solución bacteriana no es espesa, no es necesario diluirla.
2. Sala de recuento microscópico
Antes de agregar muestras, realice una inspección microscópica de la cámara de conteo de la placa de conteo. Si hay suciedad, debe limpiarse antes de contar.
3. añadir muestra
Cubra la placa del hemocitómetro limpia y seca con un cubreobjetos y luego use un cuentagotas estéril de boca fina para dejar caer una pequeña gota de la solución diluida de Saccharomyces cerevisiae desde el borde del cubreobjetos (no demasiado), para que la solución bacteriana está cerca de la brecha a lo largo de la brecha. La ósmosis capilar ingresa a la cámara de conteo por sí misma, y la cámara de conteo general se puede llenar con líquido bacteriano. Tenga cuidado de no tener burbujas de aire.
4. recuento de microscopio
Después de descansar durante 5 minutos, coloque el hemocitómetro en la platina del microscopio, primero use una lente de baja potencia para encontrar la ubicación de la cámara de conteo y luego cambie a una lente de alta potencia para contar. Si se encuentra que la solución bacteriana es demasiado espesa o demasiado delgada antes del conteo, es necesario reajustar la dilución antes del conteo. Generalmente, la dilución de la muestra requiere alrededor de 5-10 bacterias en cada celda. Cada cámara de recuento selecciona las bacterias en 5 rejillas intermedias (4 esquinas y rejillas centrales opcionales) para el recuento. Las bacterias en la línea de cuadrícula generalmente solo se cuentan en las líneas superior y derecha. En caso de brotes de levadura, cuando el tamaño del cuerpo del brote alcance la mitad de la célula madre, cuente dos bacterias. Cuente una muestra para calcular el contenido bacteriano de la muestra a partir de los valores contados en las dos cámaras de conteo.
5. limpieza del hemocitómetro
Después del uso, enjuague la placa de recuento de células sanguíneas en el grifo con chorros de agua, no la lave con objetos duros y séquela usted mismo o con un secador de pelo después del lavado. Examen microscópico, observe si hay bacterias residuales u otros sedimentos en cada celda. Si no está limpio, debe lavarse repetidamente hasta que esté limpio.
