Diferencia entre microscopio ordinario y microscopio de fluorescencia
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz para irradiar el objeto a inspeccionar, de modo que el objeto emita luz y luego observe el objeto bajo el microscopio. Se utiliza principalmente para células de inmunofluorescencia. Se compone principalmente de una fuente de luz, un sistema de placa de filtro y un sistema óptico para observar la imagen fluorescente de la muestra a través de la ampliación del ocular y la lente del objetivo. Echemos un vistazo a la diferencia entre este microscopio de fluorescencia y un microscopio óptico ordinario.
1. En términos de métodos de iluminación
El método de iluminación del microscopio de fluorescencia es generalmente episcópico, es decir, la fuente de luz se proyecta sobre la muestra de prueba a través de la lente del objetivo.
2. En cuanto a la resolución
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz. La longitud de onda es relativamente corta, pero la resolución es mayor que la de los microscopios ópticos ordinarios.
3. La diferencia en el filtro
El microscopio de fluorescencia usa dos filtros especiales, que se usan frente a la fuente de luz para filtrar la luz visible, y se usan entre la lente del objetivo y el ocular para filtrar la luz ultravioleta, que puede proteger los ojos humanos.
El microscopio de fluorescencia también es un tipo de microscopio óptico, principalmente porque la longitud de onda excitada por el microscopio de fluorescencia es corta, por lo que esto lleva a la diferencia en la estructura y el uso entre el microscopio de fluorescencia y el microscopio ordinario. La mayoría de los microscopios de fluorescencia tienen una buena función de captura de luz débil, por lo que bajo una fluorescencia extremadamente débil, su capacidad de formación de imágenes también es buena. Junto con la mejora continua de los microscopios de fluorescencia en los últimos años, el ruido también se ha reducido considerablemente. Por lo tanto, cada vez se utilizan más microscopios de fluorescencia.
Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia de dos fotones.
El principio básico de la excitación de dos fotones es: en el caso de una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo y emitir un fotón de longitud de onda más corta después de un breve período de vida del llamado estado excitado. . ; el efecto es el mismo que usar un fotón cuya longitud de onda es la mitad de la longitud de onda larga para excitar una molécula fluorescente. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones. Para no dañar las células, la microscopía de dos fotones utiliza láseres pulsados de modo bloqueado de alta energía. El láser emitido por este láser tiene un pico de energía alto y un promedio de energía bajo, su ancho de pulso es de solo 100 femtosegundos y su frecuencia puede alcanzar de 80 a 100 megahercios. Cuando se usa una lente de objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente del objetivo es la más alta, y la excitación de dos fotones solo ocurre en el punto focal de la lente del objetivo, por lo que el microscopio de dos fotones no necesita un agujero de alfiler confocal, lo que mejora la eficiencia de detección de fluorescencia.
En general, los fenómenos de fluorescencia, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón fluorescente a través de una transición radiativa, que es la fluorescencia de un solo fotón. Para el proceso de excitación de fluorescencia que usa láser como fuente de luz, puede ocurrir una fluorescencia de dos fotones o incluso de múltiples fotones. En este momento, la intensidad de la fuente de luz de excitación utilizada es alta y la densidad de fotones cumple con los requisitos de las moléculas fluorescentes que absorben dos fotones al mismo tiempo. En el proceso de usar un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para producir el fenómeno de absorción de dos fotones. Habitualmente se utiliza un láser pulsado de femtosegundos, y su potencia instantánea puede alcanzar el orden de los megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la longitud de onda de la luz de excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación a la mitad de la longitud de onda de excitación.
La microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene muchas ventajas:
1) La luz de longitud de onda larga se ve menos afectada por la dispersión que la luz de longitud de onda corta y penetra fácilmente en la muestra;
2) Las moléculas fluorescentes fuera del plano focal no se excitan, por lo que más luz de excitación puede llegar al plano focal, de modo que la luz de excitación puede penetrar especímenes más profundos;
3) La luz del infrarrojo cercano de longitud de onda larga es menos tóxica para las células que la luz de longitud de onda corta;
4) Cuando se usa un microscopio de dos fotones para observar especímenes, el fotoblanqueo y la fototoxicidad ocurren solo en el plano focal. Por lo tanto, la microscopía de dos fotones es más adecuada que la microscopía de un solo fotón para observar especímenes gruesos, para observar células vivas o para experimentos de fotoblanqueo puntual.
Conocimientos sobre microscopía de fluorescencia confocal
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal: se utiliza una fuente de luz puntual para irradiar la muestra y se forma un pequeño punto de luz bien definido en el plano focal. compuesto por divisores. El divisor de haz envía la fluorescencia directamente al detector. Hay un agujero de alfiler delante de la fuente de luz y el detector, llamados respectivamente el agujero de alfiler de iluminación y el agujero de alfiler de detección. El tamaño geométrico de los dos es el mismo, alrededor de 100-200nm; en relación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y finalmente se puede enfocar en el orificio de iluminación y el orificio de detección al mismo tiempo. De esta forma, la luz del plano focal puede converger dentro del alcance del orificio de detección, mientras que la luz dispersada por encima o por debajo del plano focal queda bloqueada fuera del orificio de detección y no se puede visualizar. El láser escanea la muestra punto por punto, y el tubo fotomultiplicador después de detectar el agujero de alfiler también obtiene la imagen confocal de la luz correspondiente punto por punto, que se convierte en una señal digital y se transmite a la computadora, y finalmente se agrega en un claro imagen confocal de todo el plano focal en la pantalla.
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra. Esta sección transversal óptica siempre tiene un cierto espesor, también conocido como sección delgada óptica. Dado que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que la del punto no focal, y la luz del plano no focal es filtrada por el agujero de alfiler, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero y el escaneo a lo largo de la Z -eje puede realizar tomografía óptica, formando una Observe la sección óptica bidimensional en el punto enfocado de la muestra. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), la imagen tridimensional de la muestra se puede obtener acumulando imágenes bidimensionales de capas continuas y procesadas por un software de computadora especial.
Es decir, el agujero de alfiler de detección y el agujero de alfiler de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano focal no puede entrar en el agujero de alfiler de detección.
La expresión simple del principio de funcionamiento del láser confocal es que utiliza el láser como fuente de luz y, sobre la base de las imágenes tradicionales del microscopio de fluorescencia, agrega un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado, y es un sistema para la adquisición de imágenes digitales y procesamiento a través del control de la computadora.
