Diferencia entre microscopio de fluorescencia y microscopio normal
1. Mira el método de iluminación
El método de iluminación del microscopio de fluorescencia es generalmente de tipo epi, es decir, la fuente de luz se coloca sobre la muestra de prueba a través de la lente del objetivo.
2. Mira la resolución
Los microscopios de fluorescencia utilizan luz ultravioleta como fuente de luz, con una longitud de onda relativamente corta, pero la resolución es mayor que la de los microscopios ópticos ordinarios.
3, la diferencia en el filtro
El microscopio de fluorescencia usa dos filtros especiales, que se usan frente a la fuente de luz para filtrar la luz visible y se usan entre la lente del objetivo y el ocular para filtrar la luz ultravioleta, que puede proteger los ojos humanos.
El microscopio de fluorescencia también es un tipo de microscopio óptico, principalmente porque la longitud de onda excitada por el microscopio de fluorescencia es corta, lo que lleva a la diferencia en la estructura y el uso del microscopio de fluorescencia y el microscopio ordinario. La mayoría de los microscopios de fluorescencia tienen una buena función de captura de luz débil. , por lo que bajo una fluorescencia extremadamente débil, su capacidad de formación de imágenes también es buena. Junto con la mejora continua de la microscopía de fluorescencia en los últimos años, el ruido también se ha reducido considerablemente. Por lo tanto, cada vez se utilizan más microscopios de fluorescencia.
Conocimiento de microscopía de fluorescencia de dos fotones
El principio básico de la excitación de dos fotones es: en el caso de una alta densidad de fotones, las moléculas fluorescentes pueden absorber dos fotones de longitud de onda larga al mismo tiempo, y después de un tiempo de vida muy corto llamado estado excitado, emiten un fotón de longitud de onda corta. ; el efecto es el mismo que usar un fotón con una longitud de onda la mitad de la longitud de onda larga para excitar una molécula fluorescente. La excitación de dos fotones requiere una alta densidad de fotones y, para no dañar las células, la microscopía de dos fotones utiliza láseres pulsados de bloqueo de modo de alta energía. Este láser emite luz láser con un pico de energía alto y un promedio de energía bajo, con un ancho de pulso de solo 100 femtosegundos y una frecuencia de 80 a 100 MHz. Cuando se usa una lente de objetivo de alta apertura numérica para enfocar los fotones del láser pulsado, la densidad de fotones en el punto focal de la lente del objetivo es la más alta y la excitación de dos fotones ocurre solo en el punto focal de la lente del objetivo. por lo que el microscopio de dos fotones no necesita un agujero de alfiler confocal, lo que mejora la eficiencia de detección de fluorescencia.
En el fenómeno de fluorescencia general, debido a la baja densidad de fotones de la luz de excitación, una molécula fluorescente solo puede absorber un fotón al mismo tiempo y luego emitir un fotón fluorescente a través de la transición de radiación, lo que se denomina fluorescencia de fotón único. Para el proceso de excitación de fluorescencia con láser como fuente de luz, puede ocurrir un fenómeno de fluorescencia de dos fotones o incluso de múltiples fotones. En este momento, la intensidad de la fuente de luz de excitación utilizada es alta y la densidad de fotones cumple con el requisito de que la molécula fluorescente absorba dos fotones al mismo tiempo. En el proceso de usar un láser general como fuente de luz de excitación, la densidad de fotones aún no es suficiente para producir la absorción de dos fotones. Habitualmente se utiliza un láser pulsado de femtosegundos, y su potencia instantánea puede alcanzar el orden de los megavatios. Por lo tanto, la longitud de onda de la fluorescencia de dos fotones es más corta que la longitud de onda de la luz de excitación, lo que equivale al efecto producido por la excitación de la mitad de la longitud de onda de excitación.
La microscopía de fluorescencia de dos fotones tiene muchas ventajas:
1) La luz de longitud de onda larga se ve menos afectada por la dispersión que la luz de longitud de onda corta y puede penetrar fácilmente en la muestra;
2) Las moléculas fluorescentes fuera del plano focal no se excitan, por lo que más luz de excitación puede llegar al plano focal, de modo que la luz de excitación puede penetrar especímenes más profundos;
3) La luz del infrarrojo cercano de longitud de onda larga es menos tóxica para las células que la luz de longitud de onda corta;
4) Al observar especímenes con microscopía de dos fotones, el fotoblanqueo y la fototoxicidad solo están presentes en el plano focal. Por lo tanto, la microscopía de dos fotones es más adecuada para ver muestras gruesas que la microscopía de un solo fotón, para ver células vivas o para realizar experimentos de fotoblanqueo de punto fijo.
Conocimientos de microscopía de fluorescencia confocal.
El principio básico de la microscopía de fluorescencia confocal: utilizando una fuente de luz puntual para iluminar la muestra, se forma un pequeño punto de luz con un contorno bien definido en el plano focal. constituido por el divisor de haz. El divisor de haz envía la fluorescencia directamente al detector. Hay un agujero de alfiler delante de la fuente de luz y el detector, llamados respectivamente el agujero de alfiler de iluminación y el agujero de alfiler de detección. Las dimensiones geométricas de los dos son las mismas, alrededor de 100-200 nm; en relación con el punto de luz en el plano focal, los dos son conjugados, es decir, el punto de luz pasa a través de una serie de lentes y finalmente se puede enfocar en el orificio de iluminación y el orificio de detección al mismo tiempo. De esta forma, la luz del plano focal se puede concentrar dentro del rango del orificio de detección, mientras que la luz dispersada por encima o por debajo del plano focal se bloquea fuera del orificio de detección y no se puede obtener una imagen. La muestra se escanea punto por punto con el láser, y el tubo fotomultiplicador tras detectar el pinhole también obtiene punto por punto la imagen confocal del punto de luz correspondiente, que se convierte en señal digital y se transmite al ordenador, y finalmente se agrega en la pantalla en una imagen confocal clara de todo el plano focal. .
Cada imagen del plano focal es en realidad una sección transversal óptica de la muestra, y esta sección transversal óptica siempre tiene un cierto grosor, también conocido como corte óptico. Dado que la intensidad de la luz en el punto focal es mucho mayor que en el punto no focal, y la luz del plano no focal se filtra por el orificio, la profundidad de campo del sistema confocal es aproximadamente cero y el escaneo a lo largo del El eje Z puede realizar una tomografía óptica, formando una sección óptica bidimensional en el punto enfocado de la muestra. Combinando el escaneo del plano XY (plano focal) con el escaneo del eje Z (eje óptico), mediante la acumulación de imágenes bidimensionales de capas sucesivas y el procesamiento mediante un software informático especial, se puede obtener una imagen tridimensional de la muestra.
Es decir, el agujero de alfiler de detección y el agujero de alfiler de la fuente de luz siempre se enfocan en el mismo punto, de modo que la fluorescencia excitada fuera del plano de enfoque no puede entrar en el agujero de alfiler de detección.
La expresión simple del principio de funcionamiento del láser confocal es que utiliza un láser como fuente de luz y, sobre la base de imágenes de microscopio de fluorescencia tradicionales, se conectan un dispositivo de escaneo láser y un dispositivo de enfoque conjugado, y la adquisición y procesamiento de imágenes digitales El sistema es controlado por una computadora.
